细胞的革兰氏染色
一． 实验目的
1．了解显微镜的构造、各部分的功能，巩固并掌握显微镜的使用。
2．学习并掌握油镜的原理和使用方法，以及微生物的制片、涂片和染色的基本技术。 3．初步认识细菌的基本形态特征。
4．掌握革兰氏染色法的原理和方法，巩固无菌操作技术。
二．实验器材及试剂
菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、自选菌。
试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、卢戈式（Lugol）碘液、95%乙醇、番红复染液、
香柏油、二甲醇等。
器材：普通光学显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、双层瓶、接种环、试管架、镊子、
滴管。
三．实验原理
1．显微镜技术
现代普通光学显微镜主要由机械装置和光学系统两大部分组成，光学部分主要有目镜、物镜和光圈调解器等。油镜的放大倍数最大，可达100倍，分辨率也最高，在100倍物镜及载玻片间滴加一滴香柏油即可，可利用油镜观察到更微小的结构。 2．简单染色
简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。 3．革兰氏染色
革兰氏蓝色法是利用两种细菌细胞壁的结构和组成的差异而进行的一种染色方
法。首先利用结晶紫出染，所有细菌都会结上蓝紫色，然后用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成复合物，增强了燃料在菌体中的滞留作用。之后用95%的酒脱色，若是革兰氏阳性菌由于细胞壁较厚等原因结晶紫未能脱去，仍成蓝紫色，而革兰氏阴性菌则被脱成无色，用番红染色后成红色。
四．实验步骤
1．简单染色 （1）涂片
取一载玻片，滴一小滴蒸馏水于正中央，用接种环由金黄色葡萄球菌（大肠杆
菌、枯草芽孢杆菌、自选菌）营养琼脂斜面挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环至于载玻片上的水滴中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀的薄膜。
（2）干燥和固定
将涂菌面朝上，快速通过酒精灯火焰2-3次，然后将载玻片放在手上降温，重
复操作，使小液滴蒸干，并使菌面固定于载玻片上。
（3）染色
将载玻片平放于实验台上，滴加染液覆盖涂菌部位即可，用结晶紫染色1min
即可。
（4）水洗
倾去染液，用自来水冲洗（将涂菌面朝下），水流不宜过急、过大，勿直接冲
洗涂片处，至洗出水无色为止。
（5）干燥
用吸水纸吸去多余水分，自然干燥。
（6）镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录，并绘制细菌的形态图。 2．革兰氏染色
（1）制片
分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、自选菌的活跃生长期菌按
简单染色的方法在同一张载玻片上从左到右涂片（不宜过厚）、干燥、固定。 （2）初染
滴加草酸铵结晶紫染液覆盖四个涂菌部位，染色1~2min后倾去染液，水洗至流
出水无色。 （3）媒染
先用卢戈式碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水
无色。 （4）脱色
先用乙醇冲去残留水迹，再在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色（一般
20~30s），当流出液无色时立即用水洗去乙醇。 （5）复染
先用番红冲去玻片上残留水迹，再用番红复染液染色2min，水洗，用酒精灯烘
干。 （6）镜检
用油镜观察四个涂菌部位，并记录革兰氏染色结果。
五．实验结果
一 革兰氏染色结果记录
菌名 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 自选菌
菌体颜色 红色 紫色 紫色 红色
菌体形态 杆状或球状 球形 杆状 杆状 结果（G+，G-） G- G+ G+ G- 六．思考题
1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加滴加香柏油有什么作用？
答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净，以防上次实验的污染，操作是先低倍再高倍，用
完要擦掉油。加香柏油的作用是增加折光率，也就是增加了显微镜的分辨率，油的折光率和分辨率成反比，同时与波长成正比。
2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。
3．什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？
答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物
镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。
4．影响显微镜分辨率的因素有哪些？
答：分辨率 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又
称\鉴别率\。
其计算公式是σ=λ/NA 式中σ为最小分辨距离；
λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小σ值，可采取以下措施: （1） 降低波长λ值，使用短波长光源。（2） 增大介质n值以提高NA值
（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角u值以提高NA值。（4） 增加明暗反差。
5．在细菌涂片时应注意哪些环节？
答：1、载玻片应该冷却后再涂片。
2、如果是涂布液体，可以用毛细管或接种环滴一小滴，然后轻轻抹开，一圈足
够。
3、如果是涂布菌落或菌苔，应该在载玻片上先滴一滴水，再将菌落或菌苔涂布上去，接种环的尖蘸一点点即可。
4、为了节省时间，可以将干燥和热固定合并成一步。但是应该避免高温，因为
温度一高，细菌会变形。
5、染色时间视染色液种类而定。如结晶紫只需几十秒，亚甲基蓝则需一到两分
钟。
6、冲洗时，水流不能太大，而且尽量避免水流直接冲在涂片上。
7、冲洗后干燥，可以用酒精灯加热以节省时间，同样的，应该避免高温，因为
温度一高，细菌会变形。
6．根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小选择不同额物镜进行有效
观察？
答：先在低倍镜下观察，把微生物移到视野中央，再逐步提高倍数，直至能看清楚
微生物的形态为止。
7．进行细菌固定时为什么要加热固定？在加热固定时应注意什么？
答：这样干燥快，同时冷却后会固定的更好。要注意温度不要太高，以免杀死微生
物。
8．为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
答：因为用油镜观察时，镜头离玻片会很近。如果未完全干燥，载玻片上的液体会
污染油镜镜头。镜头非常精密，被污染后不利于下次观察。正常情况下，观察前要用擦镜纸擦拭干净。另外，一般作细菌装片不用盖盖玻片，所以待干燥后才能
观察，如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题。
9．在进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？
答：不是都需要，有些微生物是培养在液体培养基里面的。
10．根据你的实验结果，对细菌进行单染色时，染色时间对染色效果有什么影响？为
什么？
答：染色时间过短，则染色不完全，在洗染液的时候染液被洗去，细菌未被染色好，
不利于观察。染色时间过长，会破坏细菌的一些结构，甚至影响细菌等等形态。
11．你是否观察到金黄色葡萄球菌细胞聚集形成葡萄串状？试解释其形成原因？ 答：观察到了，是由于其细胞壁的结构和成分的原因。 12．革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？
答：革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而
染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
13．为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？
答：菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 14．你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在任何情况下可以省略？ 答：复染可以省略，在已知它是阳性菌还是阴性菌的情况下可以省略。