的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。 ⑤引物的3’末端核苷酸组成
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。
需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。实验证明，以T结尾的引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸。 ⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置
所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120～300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。
其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250～750bp范围内。 ⑦补充说明
若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。
若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。
在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5’和3’末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。
3．简并引物设计
①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。很显然，我们期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。
②充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。
③应努力避免3’末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。 ④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。
4． 测序引物设计
当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计的话；那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点：
①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。
②测序引物的Tm值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低
非特异反应。
5． 探针的设计
探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论：
①探针的长短一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。
②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同时一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。 ③探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。 ④如果探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在70%以下。 PCR中常见问题分析与对策． PCR产物的电泳检测时间
一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型就会出现不规则，甚至消失。
Trouble shooting guide 1．假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μl、30μl、50μl或100μl，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μl后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。
物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下PCR仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2．假阳性
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其他不耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 3．出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时，重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法)。 4．出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。
PCR引物设计软件
PCR引物设计软件
\a PCR primer design and repeat sequence searching programme with additional tools for the manipulation and analysis of DNA and protein
The program \PCR\is based on the new approach in design PCR primers, alignment and repeat sequence searching. Program can work with several sequences simultaneously (up to 1,000,000), multiplex PCR primers design and \personal database is similar to BLAST (the algorithm for the alignment of DNA sequences is based on a segment-to-segment alignment principle similar to DIALIGN) and also others bioinformatics tools are included. Powerful and fast search of all types of repeats in DNA based on the new theory of search of repeats is developed. Now the program supports clustering sequences.
download:
http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/Others/fastpcr.exe
分子生物学软件集
分子生物学软件集 1. DNASIS 2.5
DNASIS for Windows 2.5版是日立软件公司（Hitachi Sofeware Engineering Co.,Ltd.）97年推出的一个功能强大的序列分析软件。包含有大部分分子生物学软件的常用功能，可进行DNA，RNA，蛋白质序列的编辑和分析，甚至还能进行质粒作图、数据库查询等功能，足可满足一般实验室的要求。 2. DNATools 5.1
DNATools设计的用户友好、强壮，以便快速、方便地获取、贮藏和分析序列及数据库查询获得的序列相关信息。DNATools包容性很好，能把几乎所有文本文件打开作为序列。当程序不能辨别序列的格式时（通过寻找常用序列格式的特征），会显示这个文件的文本形式，以便你编辑生成正确的蛋白质或DNA序列，编辑后可以再被载入程序。若你的序列是DNATools格式时（DNA或寡核苷酸序列），程序不加注解的载入序列，程序模式调整成可以接受载入的数据类型（蛋白质、DNA和寡核苷酸引物序列）。在一个项目中可以加入几千个序列或引物，并在整个项目中分析这些序列及标题。这个程序的一个特点是给每个序列或引物添加文本标题。这样就可以用自定义的标题识别序列，而不必通过它们的文件名。为避免丢失数据-和你的工作-DNATools包括几个挽救丢失数据的功能：一个5层的撤销/重复功能，重新获得原始序列的恢复功能，项目中加入新文件时的安全备份功能，以及在一定的时间间隔作完全备份或备份你的工。 3. DNAClub
DNA Club是一个简单的对DNA进行与PCR有关的操作的软件。它的功能有： 1、输入DNA序列； 2、查找ORF序列； 3、把DNA翻译成蛋白序列； 4、查找酶切位点； 5、查找PCR引物序列。 功能虽然都很简单，但非常实用，一般的用户都可以很方便地使用。 4. Premier5.0
是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和Motif分析窗口。这里我们主要介绍其引物设计功能，顾名思义，该软件就是用来进行引物设计的。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。而且进行这些操作非常简单。其功能绝不在Oligo 5.0之下！ 5. GeneDoc 3.2
GeneDoc能用用亮丽的色彩来区分相互间序列的同源性，输出的格式一目了然，而且可以报告为进化树的格式。选择项多，可以达到所需的要求。功能多又强，但要完全掌握，并不是很轻松的事。 6. MACAW 2.05
MACAW 是多序列构建与分析工作台软件(Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench, MACAW)是一个用来构建与分析多序列片段的交互式软件。MACAW具有几个特点：1. 新的搜索算法查寻类似区，消除了先前技术的许多限制。2. 应用一个最近发展的数学原理计算block类似性的统计学显著性。3. 使用各种视图工具，可以评估一个候选block包含在一个多序列中的可能性。4． 可以很容易地编辑每一个block。在多序列中查找一个类似片段并不是一件简单的事，主要是因为要查找的量极大。这正式MACAW所要解决的问题。 7. Clustal X
Clustal X 用来对核酸与蛋白序列进行多序列比较（multiple sequence alignment）的软件。多序列比较在分子生物学中是一个基本方法，用来发现特征序列，进行蛋白分类，证明序列间的同源性，帮助预测新序列二级结构与三级结构，确定PCR引物，以及在分子进化分析方面均有很大帮助，Clustal X很适合这些方面的要求。 8. Winplas 2.6
该软件用来绘制发表质量的质粒图，可广泛应用与论文、教材的质粒插图。其特性包括：1.知道序列或不知序列结构均能绘制质粒图；2. 可读入各种流行序列格式文件引入序列信息；3. 自动识别限制位点 可构建序列结构，功能包括：从文件插入序列、置换序列、序列编辑、部分序列删除等；4. 绘图功能强大，功能包括：
位点标签说明、任意位置文字插入、生成彩图、线性或环形序列绘制、可输出到剪贴板、可输出到图像文件；5. 限制酶消化分析报告输出与序列输入报告功能。 9. RNAdraw 1.1b2
是一个进行RNA二级结构计算的软件。 1. 它 是Windows下的多文档窗口 (multiple document interface) 软件，允许你同时打开多个数据处理窗口。主窗口的工具条提供一些基本功能：打开文件、导入文件、关闭文件、设置程序参数、重排窗口、以及即时帮助和退出程序。2. RNAdraw中一个非常非常重要的特征是鼠标右键菜单打开的菜单显示对鼠标当前所指向的对象/窗口可以使用的功能列表。 3. RNA文库（RNA Library）用一种容易操作的方式来组织你所有的RNA数据文件。 10. RNAStructure 3.5
RNA Structure 根据最小自由能原理，将Zuker的根据RNA一级序列预测RNA二级结构的算法在软件上实现。预测所用的热力学数据是最近由Turner实验室获得。提供了一些模块以扩展Zuker算法的能力，使之为一个界面友好的RNA折叠程序。 11. Cn3D
是由NCBI开发的用于观看蛋白质三维结构的软件，其设计的主要目的是为NCBI在其站点中的蛋白质结构数据库MMDB提供专业的结构观察软件，其主要的操作界面分为两个窗口，如右图所示，一个为结构窗口，另一个为序列窗口。与其他的类似的软件，如Rasmol，Weblabview等相比，其在结构观察方面主要功能上基本相似，但是图形格式上比Rasmol和Weblabview要差一些。而在与网络连接上，该软件能依托NCBI所建立的所建立的MMDB结构数据库，能直接根据输入的序列号从数据库中利用其内嵌的Entrez搜索引擎调出蛋白结构来进行观察，比其他软件要简便。而Cn3D主要的特点是能够将两个蛋白放在一起直观地进行三维结构上的比较，如下图中是将两种核酸外切酶的三维结构通过VAST对准得到的结构比较图：同样，Cn3D在结构比较方面也能利用其内嵌的Blast搜索引擎直接访问Genbank数据库找到具有局部相似性的结构数据，并在三维结构图中显示出二者具有相似性的结构区域 12. Seqverter 1.3
Seqverter 1.3使用简单，填写输入文件和输出文件名就可以完成格式转换。而且能够转换的格式非常之多是其它软件所无法比拟的。另外，它可在线升级以读写更多格式文件。 13. Visual Sequence Editor 1.1
1.可以同时显示编辑多达200个核酸蛋白序列 2.将所有程序打包成一个库文件 3.可以输入输出到很多格式序列： IG/Stanford；GenBank/GB；NBRF；EMBL；GCG；DNA Strider；Fitch；Pieron/FASTA；PIR/CODATA以及普通文本 4.可以直接读取MACAW的文件，并能将各序列中的同源顺序标出 5.根据遗传密码（可以自定义）读出一种或六种阅读框 6.查看的字体大小，字母间隔等灵活可调 7.模糊查找特定序列。 14. band leader 3.0
提供处理DNA或蛋白分子凝胶电泳图象和从凝胶电泳图象获得相关数据的工具。它可以对电泳图谱进行半定量分析，识别扫描得到的WINDOWS图象格式 .BMP，是一个难得的好软件。 15. Sequin 2.90
能向GenBank、EMBL、DDBJ三大核酸序列库递交序列。可以不用仔细考虑各数据库文件的具体格式，以问答填表格的形式，将需递交的序列和相关资料填好。可以在线直接发送，也可以生成相应格式文件，以e-mail形式发送。 16. Omiga 2.0
实际上，大部分对核酸蛋白的序列分析功能，在Omiga 2.0中都能找到；而且界面非常友好。Omiga作为强大的蛋白质、核酸分析软件，它还兼有引物设计的功能。主要功能：编辑、浏览、蛋白质或核酸序列，分析序列组成。用Clustal. W进行同源序列比较，发现同源区。实现了核酸序列与其互补链之间的转化，序列的拷贝、删除、粘贴、置换以及转化为RNA链，以不同的读码框、遗传密码标准翻译成蛋白质序列。查找核酸限制性酶切位点、基元（Motif）及开放阅读框（ORF），设计并评估PCR、测序引物。查找蛋白质解蛋白位点（Proteolytic