Sites）、基元、二级结构等。查寻结果可以以图谱及表格的显示，表格设有多种分类显示形式。利用Mange快捷键，用户可以向限制性内切酶、蛋白质或核酸基元、开放阅读框及蛋白位点等数据库中添加或移去某些信息。每一数据库中都设有多种查寻参数，可供选择使用。用户也可以添加、编辑或自定义某些查寻参数。可从MacVectorTM、Wisconsin PackageTM等数据库中输入或输出序列。另外，该软件还提供了一个很有特色的类似于核酸限制酶分析的蛋白分析，对蛋白进行有关的多肽酶处理后产生多肽片段。 17. TreeView
Tree View是用来生成与打印进化树的软件，它可以读取NEXUS与PHYLIP生成的进化树格式文件，生成进化树,并输出到打印机。 18. Antheprot
蛋白质序列分析软件包ANTHEPROT 4.5是位于法国的蛋白质生物与化学研究院（Institute of Biology and Chemistry of Proteins）用十多年时间开发出的蛋白质研究软件包。软件包包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容，功能非常强大。应用此软件包，使用个人电脑，便能进行各种蛋白序列分析与特性预测。更重要的是该软件能够提供蛋白序列的一些二级结构信息，使用户有可能模拟出未知蛋白的高级结构。 19. BioEdit
是一个序列编辑器与分析工具软件，功能非常强大，使用十分容易。功能包括：序列编辑、外挂分析程序、RNA分析、寻找特征序列、支持超过20000个序列的多序列文件、基本序列处理功能、质粒图绘制、等等等等。总之，功能强大，人人需要。 20. DNAMend
DNAmend是一名德国人编写的用于对DNA序列进行分析，编辑的专业软件，主要的用途是在基因克隆过程中，利用其提供的对DNA序列的限制性酶切分析，开读框搜索，序列转译，末端修剪等功能对DNA序列进行酶切、连接、末端补平等模拟操作，为克隆流程设计及克隆过程监视提供直观的控制工具，便于对克隆中可能出现的问题进行分析，并可将结果输出用于发表文章。 21. Bioperl 常用的分子生物学编程语言 22. Biojave常用的分子生物学编程语言 23. Oligo 2.7M
引物分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列二级结构。 24. Pcgene
pcgene在任何时候均有帮助，包括操作和pcgene计算所采取的理论原理。 pcgene软件功能有：
一、根据胶板读出序列（需特殊硬件支持）
二、核酸蛋白序列输入、修改、编辑和打印输出，物化参数计算（组成、分子量、等电点等）、特殊蛋白序列显示方式、语音序列读出 三、序列分析：
1.核酸一级结构分析：查找子序列、正向反向重复序列查找、pcr引物序列分析、转译成蛋白序列、使用embl cds自动转译、遗传密码更改
2.核酸位点分析：真核生物起始区位点分析，特殊位点检测（核糖体可能结合位点等） 3.核酸表达区分析、序列比较、限制酶位点分析、核酸同源性比较、核酸序列参数统计信息 4.核酸二级结构分析：回行结构分析、RNA结构、DNA螺旋、tRNA序列查找 5.蛋白一级结构分析：查找子序列、蛋白->核酸序列、最佳寡核甘酸探针 6.蛋白位点分析、断点分析、同源序列比较、二级结构分析、序列统计结果
7.序列可以是单个的，也可以将它装入数据库分子生物应用软件pcgene共四张（1.44M） rar压缩 25. Blast 2.2.3 2002-5-15
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的计说明。BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。BLAST还能发现具有缺口的能比对上的序列。 BLAST是基于Altschul等人在J.Mol.Biol上发表的方法
(J.Mol.Biol.215:403-410(1990)),在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。从最初的BLAST发展到现在NCBI提供的BLAST2.0,已将有缺口的比对 序列也考虑在内了。BLAST可处理任何数量的序列,包括蛋白序列和核算序列;也可选择多个数据库但数据库必须是同一类型的,即要么都是蛋白数据库要么都是核酸数据库。所查询的序列和调用的数据库则可 以是任何形式的组合,既可以是核酸序列到蛋白库中作查询,也可以是蛋白序列到蛋白库中作查询,反之亦然。
1、BLASTP是蛋白序列到蛋白库中的一种查询。库中存在的每条已知序列将逐一地同每条所查序列作一对一的序列比对。
2、BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白），再对每一条作一对一的蛋白序列比对。
3、BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。
4、TBLASTN是蛋白序列到核酸库中的一种查询。与BLASTX相反，它是将库中的核酸序列翻译成蛋白序列，再同所查序列作蛋白与蛋白的比对。
5、TBLASTX是核酸序列到核酸库中的一种查询。此种查询将库中的核酸序列和所查的核酸序列都翻译成蛋白（每条核酸序列会产生6条可能的蛋白序列），这样每次比对会产生36种比对阵列。
增加PCR的特异性： 1. primers design
这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件
a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~~~~60%
c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端的错配 g. 避免内部形成二级结构
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补和二级结构是要加上它们
i. 需要使用兼并引物时, 要参考MM子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM)
j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃ 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
3. optimize reactants concentration a. magnesiom ions
Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性 一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整
同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度 对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液 b. 其他的离子
NH4+ K+都会影响PCR
增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency).
NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的.
当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了. c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度
一些高保真酶的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性 d. template
50ul PCR SYSTEM
================================ human gDNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng LamadaDNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng ================================
4. termperature a. denaturation
常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟
除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时
给予较长的时间,而取消开始的denaturation b. annealing 重点到了
一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险.
另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很简单,但的确是一个很有用的方法 举个例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度 94 5min
94 30s 60 30s
72 1min 2cycles
94 30s 59 30s
72 1min 2cycles
94 30s 58 30s
72 1min 2cycles
........
94 30s 51 30s