第二章 高效液相色谱分析
§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）
2.1.1 高效液相色谱法的特点 1、与经典液相色谱法比较
2、与气相色谱法比较
3、高效液相色谱法的发展
A、固定相的变化
填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。目前，出现使用1.0μm填料的超高压液相色谱。
B、流动相变化
目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID和FPD检测器的HPLC。 C、全新方法
剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC与MS、NMR、IR联用的多维液相色谱法。
4、高效液相色谱法的特点
①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；
—9—11
④高灵敏度：10g（UV）；10g （荧光检测）。 5、高效液相色谱法的局限
①溶剂用量太大；
②缺乏诸如气相色谱使用的TCD、FID通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa～1MPa压力。
§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）
2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素
高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于
流动相的不同。现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：
高效液相色谱的范氏方程：
22?Csd2CdDm?CmdpCsmdpfH?2?dp????u?u ??D?uDDms??m若将上式简化，可写作：
BH?A??Cu
u这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，
影响柱效的主要因素是传质项。 1、涡流扩散项He
He?2?dp
式中——?：填充不规则因子；dp：填料平均直径。
? 它与载体流速无关； ? 若柱子填充均匀，填料的颗粒也均匀，则??0?He?0?柱效高；若填充不均匀，?↗?He↗?柱效低。 2、纵向扩散项Hd CdDm u式中——Cd：常数；Dm：扩散系数；u：流动项的线速度。
Hd?? 由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4~5个数量级，因此在液相色谱中，当流动相线速度大于0.5 cm?s?1时，这个纵向扩散项对色谱峰扩展的影响实际上是可以忽略的，而气相色谱法中这一项却是重要的。 3、传质阻力项 （1）固定相传质阻力项Hs
Hs?Csd2fDsu
式中——Cs：与k（容量因子）有关的系数；df：固定液厚度；Ds：扩散系数。 ? 固定相引起峰扩展解决办法： ①液液分配色谱：使用薄的固定相； ②吸附、排阻和离子交换色谱：使用小颗粒填料。 （2）流动相传质阻力项 ①流动的流动相中的传质阻力项Hm
Dm式中——Cm：常数（与k有关，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构）；
Dm：流动相中扩散系数；dp：为填充物的平均直径。
②滞留的流动相中的传质阻力项Hsm
? 原因：多孔固定相造成的部分流动相滞留。
2CsmdpHsm??u
Dm式中——Csm：常数（与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关）。 ? 固定相的粒度?0?其微孔孔径???传质途径?0?传质效率???柱效???。 2.2.2 液相色谱的H?u曲线
1、液相色谱与气相色谱H?u曲线的区别
Hm?2Cmdp?u
①HPLC板高H比GC小一个数量级，说明HPLC柱效高； ②对于HPLC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。 2、降低H，提高柱效的方法
①减小填料粒度； ②减小填料孔穴深度；
③用低粘度溶剂作流动相；
④采用低速流动相（通常：u?1 mL?min?1）。
§2.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理（理解）
根据固定相和分离机理的不同，液相色谱法可分为： 1、液液分配色谱法（LLC） 2、液固吸附色谱法（LSC） 3、离子对色谱法（IPC）
4、离子交换色谱法（IEC） 5、离子色谱法（IC）
6、空间排阻色谱法（SEC）
2.3.1 液—液分配色谱及化学键合相色谱
1、液—液分配色谱——基于组分在两相间的分配容量因子k的差异而实现分离的。 A、固定相：载体+固定液 全多孔型担体 β，β'-氧二丙腈 表面多孔型担体 聚乙二醇
异三十烷（角鲨烷） B、载体：硅胶； C、分类：
根据固定液和流动相（溶剂）的极性不同，可分为正相液液分配色谱和反相液液分配色谱。 ? 为了避免固定相流失，固定相和流动相极性要相差大。（与GC不同，GC：极性相似相溶 ） ? 分析对象与固定液极性一致； ? 正相色谱：固定液为极性，流动相为非极性（固定液极性＞流动相极性）； ? 反相色谱：（应用最普及） H2O、甲醇等使用方便；价格便宜 ? 固定液为非极性，流动相为极性； ? 由于液—液分配色谱固定相易流失，现已被化学键合相色谱所替代。 D、原理：
由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。当达到平衡时，物质的分配同样服从下式：
CVK?s?km
CmVs式中——K：分配系数；k：容量因子；Cs：溶质在固定相中的浓度；Cm：溶质在流动相中
的浓度；Vm：流动相体积；VS：固定相体积。 ? 分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，后出峰； ? 液相色谱法中，流动相的种类对分配系数有着较大的影响。 E、应用：液—液色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。
2、化学键合固定相色谱
通过化学反应将有机基团键合到硅胶（载体）表面上，代替机械涂渍的液体固定相。这种固定相避免了固定相流失，大大改善了固定相功能，适用于梯度洗脱，分离选择性大大增加。 ? 化学键合相色谱的出现，是HPLC的重大突破； ? 化学键合色谱是HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三； ? 它适用于分离几乎所有类型的化合物。 2.3.2 液—固吸附色谱法——流动相：液体，固定相：吸附剂 1、原理：基于组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而分离的。
『组分分子结构与吸附剂几何结构相适应时，易于吸附。』 2、固体吸附剂主要类型： ①极性的硅胶（应用最广）； ②氧化铝； ③分子筛；
④非极性的活性炭 。 3、应用：
①分离几何异构体；
②分离含极性基团相同但数目不同的试样，但不能用于分离同系物； ③分离具有中等分子量的非极性或极性的、非离子型的油溶性样品。 4、缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象
2.3.3 离子对色谱法
分离强极性的有机酸、碱存在的问题：
? 用正相色谱：保留值太大、峰拖尾，甚至不出峰 离子对色谱法 ? 用反相色谱：保留太小
1、定义：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对电子或反电子）加入到流动相或
固定相中，使其于溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行 为。
2、分离机理
离子对色谱的分离机理有不同的假说，现以离子对分配机理说明：
在色谱分离过程中，流动相待分离的有机离子X+（也可以是带负电荷的离子）与固定相或流动相中带相反电荷的对离子Y—结合，形成离子对化合物X+Y—，然后在两相中分配：
KXY???????X?Y有机相X水相?Y水相 ????? 由于离子对疏水性质不同，导致各组分保留时间不同； ? 离子对试剂： 分析碱→烷基磺酸钠； 分析酸→四丁基季胺盐。 2.3.4 离子交换色谱法 1、固定相：离子交换树脂
流动相：水缓冲溶液；甲醇；乙醇+水缓冲溶液
2、原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子
半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；
阳离子交换：R—SO3H+M+＝R—SO3M+ H + 阴离子交换：R—NR4OH+X—＝R—NR4 X+OH— 3、适合于分析：
①在溶液中能形成离子的组分
②有机物和生物物质，如：蛋白质、氨基酸、核酸等的分离。
2.3.5 离子色谱法
离子色谱以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象，近30年有了迅速发展。 1、离子交换色谱存在问题：
用电导检测器检测，流动相是强电解质，强背景完全掩盖待测离子信号。 2、抑制柱：使高背景电导的流动相转变为低背景的流动相。 ? 1975年Small提出在离子交换柱后，再串结一根抑制柱。 ? 抑制柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。 如：分析阴离子样品Br—，NaOH为流动相；抑制柱为R—H+；
通过抑制柱后：
NaOH +R—H+ →H2O +R—Na NaBr +R—H+ → HBr +R—Na
? 由于H+淌度为Na+的7倍，提高了检测的灵敏度； ? IC还可以分析氨基酸、糖类及有机阳离子；
? 由于抑制柱要定期再生，现代IC中，多采用在离子交换柱后接抑制器来实现以上目的。 3、阴离子分析示例：
七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离 各组分含量：3～50 ppm；