年生物化学实验B 实验报告 姓名： 学号： 实验时间： 实验分组： 组内成员： 任课教师：
小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量
摘要本实验从新鲜且冷冻保存的小牛肠出发,通过刮取、离心分离、析出、提纯等方式提取小牛肠中碱性磷酸酶，利用紫外分光光度法测定该酶的活性，并利用考马斯亮蓝法测定所提取的蛋白质含量，最后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对比marker谱带近似得出蛋白样品中蛋白质的相对分子量。
关键词碱性磷酸酶；分离纯化；酶活；紫外分光光度法；考马斯亮蓝；蛋白质；聚丙烯酰胺凝胶；蛋白质分子量。 前言
碱性磷酸酶能催化核酸分子脱掉5’-磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。主要应用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。
本实验以小牛肠为原料，分离纯化小牛肠碱性磷酸酶并研究酶活。小牛肠碱性磷酸酶的分子量为145000，等电点为5.7.碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠，使之水解释放出对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收。通过测定吸光值的变化率，可测定酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。
应用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，是一种常用的蛋白质快速微量测定法。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为465nm，后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.01～1.0mg/ml）,蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白酶分子质量，根据标准样品在电泳中所做出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。1
实验部分
1.1 试剂与仪器
1.1.1试剂
（1）正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）；
（2）1 mol/L 醋酸（HAc），1 mol/L NaOH，硫酸铵； （3）平衡缓冲液：0.01 mol/L Tris-HCl，pH=8.0； （4）底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液,pH=9.8；
（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液（已
加入到底物缓冲液中）；
（6）30% 丙烯酰胺（acrylamide，Acr）置棕色瓶；
（7）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH=8.8，已加入10% SDS； （8）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH=6.8，已加入10% SDS；
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（9）10% 过硫酸铵（AP）（小离心管装，提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所
必需的自由基，需新鲜配制）；
（10）TEMED（四甲基乙二胺）（小离心管装T，通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合）；
（11）上样缓冲液（小离心管装S）：称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加
0.1 mL巯基乙醇、2 mL 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至10 mL；
（12）染色液：配置含0.1% 考马斯亮蓝R250，40%（体积分数）甲醇和10%（体
积分数）冰醋酸的染色液500 mL，过滤后备用；
（13）脱色液：500 mL 10%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的脱色液1000 mL；
（14）电泳缓冲液（含0.1%SDS，0.05mol/L Tris,0.384mol/L 甘氨酸pH=8.3）。 1.1.2仪器
匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿（光程0.5cm和1.0cm各两个）、电泳仪、电泳槽、制胶板、揺床。
1.2实验过程
1.2.1小牛肠碱性磷酸酶的提取
1）取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。 2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加1.5倍体积冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复20次。
3）缓慢加入（总体积）一倍体积冰冷正丁醇高速匀浆15s，重复20次。取60mL匀浆液放入离心管中，另一离心管用水配平，在4℃、10000 rpm条件下离心15min。
4）用滤布过滤去除杂质（滤饼），倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用1mol/L HAc溶液调pH到4.9。4℃、10000 rpm条件下，离心10min。 5）得到上清液29.5ml放入离心管中，用NaOH溶液调pH至6.5，称取1.475g硫酸铵加到离心管中溶解；再加13.87ml冰冷丙酮，混匀，4℃静置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心10min。
6）上清液中42.0ml ，加入45.0ml冰冷丙酮，4℃放置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心10min。
7）取沉淀溶于1.5ml 平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。 8）底物处理：底物37℃水浴5 min。
1.2.2小牛肠碱性磷酸活的检测
1）将酶稀释10倍。
2）紫外分光光度计检测条件为405 nm波长，测定时间60 s，取值2 s，记录范围0.0-1.5。
3）取2个2 mL比色皿（光程0.5cm），加入上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。
4）将稀释10倍的酶液20μL加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速上下倒2次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线
1.2.3考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
1）玻璃试管中加入5ml考马斯亮蓝。 2）在1.5 mL离心管中，取酶液稀释10倍。
3）取100μL加入到5 mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5 min以上（液体呈浅蓝色）。
4）紫外分光光度计检测条件：595 nm 波长。
5）取2个比色皿（1.0cm光程），加入考马斯亮蓝（比色皿三分之二），分光光度计中校对归零。
6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值。 7）根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度。
1.2.4聚丙烯酰胺凝胶制备
1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，
上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。
2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。
分离胶制备（浓度10%，制备量10 mL）
试剂
H2O
30% 丙烯酰胺
1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8
10% 过硫酸铵 TEMED
用量 4.1 mL 3.4 mL 2.4 mL 100 μL 10μL
注意：最后加入TEMED，应快速摇匀分离胶，向玻璃板间隙，沿着长玻璃板的内侧缓缓注胶，然后再用移液枪贴壁慢慢移动注入乙醇200μL，以防止氧气进入胶内。10-15min后，分离胶和乙醇之间出现分界线，表明分离胶凝固，倒出乙醇。
3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。
浓缩胶制备（浓度5%，制备量6 mL） 试剂 用量 H2O 3.4 mL
1.0 mL 30% 丙烯酰胺
1.5 mL 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 6.8
60 μL 10% 过硫酸铵
TEMED 8 μL
注意：一旦加入TEMED，应快速摇匀浓缩胶，在已凝固的分离胶层上加浓缩胶，立即将梳子插入胶液顶部，避免进入气泡，放置约20min,待浓缩胶凝固。
4）蛋白样品处理：在1.5 mL离心管中按1：1体积比例，加样品（0.3mL）和上样缓冲液（0.3mL），100?C加热3min使蛋白变性。
5）浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子，将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。 1.2.5SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量
1）用移液枪依次在泳道各加样20微升，并在中间泳道加marker溶液。 2）电泳：连接正、负极，打开电源。开始时电流控制在40mA，样品进入分离胶后
缓慢升高电压至140V，或电流50~60mA保持电压电流不变，待溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳（约1.5小时）。
3）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，用金属片从玻璃板两侧
轻撬，使空气进入，同时用水冲洗，取出凝胶板，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色10min。
4）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，30min换一次脱色液，脱色至背景清晰。
5）观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。 6）拍照电泳结果，用于完成实验报告。