2 结果与讨论
2.1考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
根据考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线，其方程为：y=0.697x-0.007(相关度R^2=0.9989)； 蛋白质稀释10倍的情况下测得吸光值为0.2283 A。 根据方程计算，稀释10倍时蛋白质浓度C1=0.3375mg/ml 则原蛋白质浓度C=3.376mg/ml
2.2小牛肠碱性磷酸活性的检测
用分光光度计测定酶动力曲线。
405nm波长下的吸光值的变化率
根据酶动力计算公式：
?A/min? VR? D
比活力（U/mg）＝ E405? VE? C?L
由图可知:?A/min=（0.2600-0.0300）/min=0.2300/min,405nm波长下的吸光值的变化率；
VR=1.52ml，反应液的体积，ml； D=10，稀释倍数；
E405=18.3L/(mol·cm)，405nm波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数； VE=0.02ml，所加酶液体积，ml；
C=3.376mg/ml，蛋白的原始浓度，mg/ml； L=0.5cm，比色皿光程；
所以比活力（U/mg）=5659U/mg（说明酶的活性还是很高的）。
2.3 SDS-聚丙烯凝胶电泳
根据电泳图可知，mark中出现了4条明显的蛋白质标记线，根据其间距（即相对分子量的差距）及参考文献中给出的mark泳道（左数第六条）各条蛋白质标记线间距，可判定由上到下mark泳道中的4条蛋白质标记线分别是兔磷酸化酶B（97400），牛血清白蛋白（66200），兔肌动蛋白(43000),牛碳酸酐酶（31000）。样品蛋白质标记线与牛血清白蛋白（66200）迁移率相近，所以样品的分子量与牛血清白蛋白分子量相近，所以样品的分子量大致为66200g/mol。发现样品中存在一些较浅的的标记线，原因可能是存在一些杂质蛋白，造成样品不纯，今后的实验中应注意分离提纯的操作。 2.4思考与讨论
在测定底物浓度对酶反应速度的影响时，要对反应温度、酶浓度进行控制，本实验将反应底物恒温37℃水浴5分钟，保证了反应温度统一（加入酶液产生的温度变化可忽略不计），酶浓度为在原来酶浓度的基础上稀释10倍，这样酶的浓度比较适宜，便于测量。小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定实验中，最关键的地方在于提取酶的时候要在低温环境下，防止酶失活，所以所用的丙酮等溶剂均是从冰箱中取出。另外，测定酶活力的时候底物预热后要立即进行反应，防止底物提前分解影响实验测定。
在电泳实验中，电极缓冲液中加入甘氨酸，其与Tris一起组成电极缓冲液中的缓冲对，使得电泳时pH变化不大，保证实验的条件不变，消除pH对实验的影响。分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP，TEMED可以通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺
的聚合而AP提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必需的自由基。在电泳中，加入十二烷基硫酸钠（SDS），可使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，即可推算出被测蛋白样品分子量的近似值。 2.5 成败分析与感想
参考文献
[1]许文涛等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究.食品科学[J]. 2004,Vol.25.No.增 [2]修志龙等.生物化学[M].化学工业出版社.2008.
[3]孙士青等.考马斯亮蓝法快速测定乳品中蛋白质含量.山东科学[J].2011.24(6) [4]栾雨时, 包永明..生物工程实验技术手册[M].化学工业出版社.2005.
Purification and calf intestinal alkaline phosphatase activity assay、Coomassie blue method for the determination of protein content、SDS-PAGE electrophoresis method for the determination of protein
molecular weight
Jinmeng
Dalian University of Technology Faculty of Chemical, Environmental and Biological Science and Technology
Fine Chemical Industry 1101 Class
Abstract This experiment begins with a freshandlow temperature preserved calf intestinebyscraping, centrifugation, precipitation, purification ,etc.to
extractalkaline phosphatase in thecalf intestinal.Determining the activity of the enzymein the ultraviolet spectrophotometric method.UsingCoomassie brilliant blue method to determine the extractedproteincontent.Finaly,determiningtheapproximate relative molecular weight of proteins in the protein sample by comparing marker’sbands in the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method.
Keywords Alkaline phosphatase. Separation and purification;Enzyme activity;UV spectrophotometry；Coomassiebrilliant blue method. Protein； Polyacrylamide gel；Protein molecular weight.