中国农业科学 2015,48(17):3372-3387 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.17.005
中国转基因棉花研发应用二十年
郭三堆，王 远，孙国清，金石桥，周 焘，孟志刚，张 锐
（1中国农业科学院生物技术研究所/国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京100081；2全国农业技术推广服务中心，北京 100125）
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摘要：转基因技术是指利用重组DNA原理，将优良目的基因整合到靶标生物基因组中，并使靶标生物得以表达目的性状的技术。这一技术克服了生物有性杂交的限制，使物种间基因交流的范围无限扩大，既可以从原核生物到真核生物，也可以从单细胞生物到多细胞生物，还可以从低等生物到高等生物，反之亦然。因此，这项技术自发明以来，即广泛应用于农业、林业、医学等领域，为其研究开辟了一个全新的时代。转基因植物是以农杆菌等为媒介，将来源于动物、植物或微生物等其他生物甚至人工合成的外源基因转入基因组中，使之稳定遗传并赋予其靶标性状，如抗病、抗虫、抗逆、高产、优质等的植物。以1972年构建第一个重组DNA分子为契机，1983年首次获得转基因烟草为起点，植物转基因技术在近30年的时间内发展迅猛，至今已有200多种植物已成功获得转基因株系，40多种数千例转基因植株进入田间试验。根据国际农业生物技术应用咨询服务中心（ISAAA）统计，全球转基因植物的种植面积由1996年的260万hm2已经迅速增到2014年的1.815亿hm2，累计种植面积大约比中国国土总面积还多80%。在全球转基因植物研发和应用迅猛发展的同时，中国也先后批准了7种转基因植物的生产应用，其中，抗虫棉是唯一大规模应用的转基因农作物。从1994年中国研制成功国产单价抗虫棉（GK），以及1995年美国保铃棉进入中国至今，抗虫棉已经在中国推广应用了近20年的时间。文章介绍了这20多年来，中国科学家在抗虫、抗旱耐盐碱、抗除草剂、抗病以及纤维品质改良等性状方面所取得的转基因棉花研究进展；在农杆菌介导、基因枪轰击、花粉管通道介导、茎尖或芽尖转化、农杆菌液浸染和纳米载体花粉介导等不同转化技术上所进行的探索；同时，介绍了中国转基因植物的安全性评价状况，并从抗虫棉品种审定、发展趋势和产业化状况几个方面，介绍了转基因抗虫棉在中国的应用，最后对未来转基因棉花研究方向进行展望。
关键词：抗虫棉；转基因；安全评价；品种；产业化
Twenty Years of Research and Application of
Transgenic Cotton in China
GUO San-dui1, WANG Yuan1, SUN Guo-qing1, JIN Shi-qiao2, ZHOU Tao1, MENG Zhi-gang1, ZHANG Rui1
(1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and
Genetic Improvement, Beijing 100081; 2The National Agro-Tech Extension and Service Center, Beijing 100125)
Abstract: Genetic engineering mainly deals with the transfer and expression of functional genes into the targeted genome of an organism to have desired phenotype. This technique has stunned the limitations of sexual hybridization by allowing the transfer of genes among species from prokaryotes to eukaryotes, unicellular to multicellular, lower organisms to higher organisms and Vice versa. This technology has opened the avenues of research, and since its invention scientists are readily using it in the field of agriculture, forestry and medicine. The use of different techniques like agrobacterium mediated transformation has made it possible to transfer different genes to the targeted genomes for deploying the resistance against biotic and abiotic stresses like diseases, insect/pests, drought and salinity as well as for the improvement of yield and quality of plants. Since the birth of first transgenic 收稿日期：2015-01-19；接受日期：2015-06-15 基金项目：国家“863”计划（863-Z17-01-01）、农业部“发展棉花专项资金”（99044）、科技部“转基因植物产业化”专项（J99B-002）、中华农业
科教基金（99-01-04）、国家计委高科技产业化示范工程（计高技-20010482）、转基因生物新品种培育重大专项（ZX08005-004）
联系方式：郭三堆，Tel：010-82106140；E-mail：guosandui@caas.cn
17期 郭三堆等：中国转基因棉花研发应用二十年 3373
tobacco in 1983, more than 200 plant species have been used by the researchers for genetic transformation and some thousands of transgenic plants of 40 species are under field trials. International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA) has reported the dramatic increase in area under transgenic plant, i.e. 2.6 million hectares in 1996 to 181.5 million hectares in 2014 around the whole globe. The accumulated area of transgenic crops in the world is 80% more than the total land of China. With the global large scale adoption and application of transgenic plants development technology, seven transgenic plants also have been approved by Chinese government for general cultivation. Among these, insect resistant transgenic cotton including series of GK and SGK cotton cultivars developed by the Chinese scientists in 1994 and 1998 respectively, as well as the Boll guard imported from USA in 1995 was the only crop occupying the large cultivated area of China. This paper discussed the course of development of transgenic cotton for resistance against diseases, insects and herbicides as well as for the improvement of fiber yield and quality in China and improved methods of genetic transformation like Agrobacterium mediated, tissue culture, gene gun bombardment, pollen tube pathway, shoot tip, floral-dip and nano-carrier pollen mediated transformations. Finally this paper also discussed the biosafety system regarding the transgenic plants development, Bt cotton seed industry and future prospects of transgenic cotton in China.
Key words: insect resistant cotton; transgene; biosafety evaluation; variety; industrialization
0 引言
从1994年中国研制成功单价抗虫棉（GK），以及1995年美国保铃棉进入中国以来，抗虫棉在中国推广应用了近20年的时间。在这期间，虽然中国先后批准了7种转基因植物生产应用，但在中国转基因农作物产业化应用方面，抗虫棉仍然是一枝独秀[1]。
本文介绍了20多年来，中国科学家在抗虫、抗除草剂、抗旱耐盐碱、抗病、纤维品质改良等转基因棉花研究方面所取得的进展，以及在农杆菌介导、花粉管通道、茎尖转化等不同转化技术上所进行的探索。同时，以国产抗虫棉为例，介绍了中国转基因生物安全性评价体系，概述了抗虫棉在中国的产业化历程，并对转基因棉花的研究方向作出进一步展望。
1.1 抗虫转基因棉花
中国抗虫基因的研制起始于20世纪90年代初期，通过遗传转化方法使棉花获得抗虫功能的基因主要包括三类：来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因（Bt）、从植物中分离的昆虫蛋白酶抑制剂基因（PI）和植物凝集素基因（1ectin）。当前，大规模生产应用的国产转基因抗虫棉主要为单价抗虫棉和双价抗虫棉，其遗传转化的抗虫基因为Bt杀虫基因GFM Cry1A和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因Cpti。
1992年，郭三堆等[2]利用分子设计技术人工合成了具有高杀虫活性的Bt杀虫基因GFM Cry1A并于1994年将该基因导入棉花，在此基础上与育种单位合作，成功选育出GK1、GK12、GK19、GKZ1和晋棉26国产单价转基因抗虫棉品种，并大面积推广应用，使中国成为继美国之后世界上第二个研制成功转基因抗虫棉的国家。之后，为了提高抗虫棉的杀虫效率、延缓棉铃虫等害虫对杀虫蛋白产生抗性，郭三堆等[3]将2个不同杀虫机理的抗虫基因GFM Cry1A和Cpti同时导入棉花，创制了双价转基因棉花新种质。通过与国内多家育种单位合作，成功选育出sGK321（1998年）、中棉所41（2001年）和中棉所45（2003年）等双价转基因抗虫棉新品种。田间抗虫性试验结果表明，2、3、4代棉铃虫平均双价抗虫棉百株幼虫数量分别比常规棉田减少81.4%、87.1%和87.0%，分别比单价抗虫棉田减少11.1%、33.3%和57.1%[4]。双价转基因抗虫棉的研制成功，不仅在抗虫性上比单价抗虫棉优越，更重要的是丰富了抗虫棉种质资源，加速了抗虫棉新品种的培育和推广应用[3]。
此外，转GFM Cry1A和Cpti双价转基因抗虫棉的大面积推广应用，为高效广谱抗虫棉的研制奠定了
1 不同类型转基因棉花研究进展
利用基因工程技术对棉花进行遗传改良是棉花分子设计育种的主要途径，有效地弥补了传统育种方法不能解决的问题，快速地培育出多种新型棉花育种材料。棉花遗传改良主要涉及抗逆、抗除草剂、纤维品质和早衰等重要农艺性状改良。其中，抗逆基因工程培育的抗虫转基因棉花和抗除草剂转基因棉花得到了广泛的生产应用，并取得了巨大的经济和生态效益。同时，为解决粮食增产与耕地面积不断缩小的矛盾，使棉花能够在粮食作物不能种植的干旱地和盐碱地进行栽培生产，培育具有优质、高产、耐旱耐盐碱、抗病、抗早衰等重要农艺性状的新型转基因棉花材料成为当前棉花遗传改良的研究热点。此外，适宜于南方多雨高湿地区栽培的耐涝转基因棉花等特殊用途的新材料培育也取得了一定的进展。
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理论基础，推动了新抗虫基因的研制和应用，尤其是在抗棉铃虫和蚜虫等棉花主要害虫的防治方面取得了突破性的进展。王伟等[5]利用根癌农杆菌介导遗传转化方法获得含有豌豆外源凝集素基因P-Lec和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因SKTI的双基因转基因棉花，对蚜虫表现出高效的抗虫性。刘志等[6]将Cry1A和雪花莲凝集素基因GNA导入棉花，选育获得转Cry1A+GNA双基因抗虫棉花纯合株系TBG，在苗期、蕾期、开花期和结铃期主茎叶都对棉铃虫幼虫具有很高杀虫活性。同时，TBG植株在不同生育时期对棉蚜群体也表现出明显的抑制效果，其苗期和蕾期抑蚜率分别达到了50.31%和46.61%。吴家和等[7]将入工设计合成的Cry1Ac、Bt29K和慈菇蛋白酶抑制剂基因API-B导入棉花，培育出9个抗虫性好、农艺性状优良的转基因棉品系，对棉铃虫抗性均达到90%以上。肖松华等[8]将野生荠菜凝集素基因（WSA）导入常规陆地棉品种，对9个高品质转WSA棉花株系进行抗蚜鉴定，结果表明，转基因棉花株系对棉蚜均表现出较高的抗性。张林水等[9]将Cry1Ac3与Cpti的融合基因和GNA共转化棉花，获得了同时含有3个抗虫基因的转基因棉花新材料，该材料对棉铃虫具有较高的抗性。雒瑶瑜等[10]将Cry1Ac与Cry2Ab导入棉花，获得了双基因抗虫棉育种材料2009002。该转基因棉花除了抗棉铃虫外，对小地老虎、刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害虫有一定的抗虫性。
多基因共转化抗虫棉花的研制为中国后续抗虫基因的研制和应用研究开拓了新思路。通过构建多基因植物表达载体共转化不同杀虫机制的抗虫基因，或者通过基因聚合技术将多个抗虫基因聚合于一个转基因棉花材料内，培育获得含有多个基因的转基因抗虫棉。不仅可以使棉花受体获得多种机制的抗虫性，利用基因互补的方式加强转基因棉花的抗虫能力延缓害虫产生抗（耐）性，而且可以拓宽棉花抗虫谱，使其获得能够高效杀死主要害虫的广谱抗虫性[11]。 1.2 抗旱耐盐碱转基因棉花
中国水资源的短缺，土壤盐渍化和频繁的极端天气严重影响作物的生产，此外，在有限耕地的前提条件下，粮棉征地的矛盾日益凸显，通过研究抗逆基因提高棉花的抗逆能力，将有效地提高土地利用率，拓展可利用土地资源。近年来，中国在抗旱耐盐碱基因的研究方面取得了一些重要进展。
1.2.1 抗旱转基因棉花 水资源的日益缺乏，全球温室效应的不断加剧，对棉花生产带来了极大挑战，因
此，抗旱基因的相关研究对于提高棉花产量和加强盐碱地及干旱地的开发利用具有极其重要的意义[12]。吕素莲[13]将来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶（CDH）基因betA导入棉花，发现该基因能够显著提高转基因棉花的抗旱和耐盐性，通过棉花苗期和蕾期的渗透（干旱）及盐胁迫试验发现来自于盐芥的TsVP可以提高转基因棉花的抗渗透（干旱）和盐能力，该工作一方面为培育抗旱、耐盐棉花新品种创造了优异材料，为中国棉花生产和大面积的盐碱地开发利用作出了力所能及的贡献；另一方面为深入了解棉花抗旱、耐盐的分子机制提供了重要资料，开辟了新的途径。
曹燕燕等[14]通过对rolB的功能研究，
发现该基因不仅使转基因棉的茎粗明显提高，而且还使其生根能力明显增强，根/冠比显著大于对照，表现为根系更为强大，抗旱性更强。王娟[15]对转ZmPIS棉花植株在苗期、蕾期和开花期的干旱胁迫研究表明转基因棉花的一些株系具有较强的渗透调节能力，其抗旱能力显著提高，转基因棉花植株具有较强的渗透调节能力，此外，王娟[15]通过杂交，将来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶（CDH）基因betA和来自于盐芥的TsVP聚合在一起，结果表明，转基因聚合植株与转单基因植株相比具有较高的耐旱性。吴伟[16]在前人研究的基础上，对聚合ZmPLC1和betA的转基因聚合棉花进行耐旱性研究，结果表明，与野生型对照和转单基因对照株系相比，转基因聚合株系具有更高的干旱耐性，而且相比于野生型对照株系和转单基因对照株系，转基因聚合株系具有更高的籽棉和皮棉产量，这表明通过基因聚合手段提高植物抗逆性是可行的。杨云尧[17]将MvP5CS和MvNHX1整合到棉花中，通过研究发现转基因株系能够提高棉花的抗旱能力。蔡永智[18]在转基因棉花中对来源于葛兰菜的CBF1和来源于大肠杆菌的KatG进行功能研究，发现在干旱胁迫下，转CBF1和KatG棉花在光合作用、叶绿素荧光参数、生理生化以及农艺性状方面均表现出优良的生长和生理优势。说明这两个基因能通过提高抗逆能力来提高转基因棉花的产量。钱进等[19]通过分析转MvNHX1的10个T5棉花株系在干旱胁迫后的生理指标和农艺性状，发现经干旱胁迫后转基因植株光合作用更强，根系更发达，吸收水的能力更强，农艺性状方面，转基因株系的有效铃数、有效果枝数、单铃重、皮棉、子棉和衣分等指标明显高于对照，这些株系可以作为后续遗传育种材料[20]。
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1.2.2 耐盐碱转基因棉花 棉花是公认的耐盐、抗旱作物，克隆优良耐盐碱基因，导入棉花选育耐盐棉花品种，提高棉花对盐渍环境的适应能力，利用围垦改造的滩涂地，种植转基因耐盐碱棉花，是减轻土壤盐渍化危害以及开发利用沿海滩涂等盐渍化土地资源的重要途径之一，是缓解粮棉争地矛盾的重要策略。张慧军等[21]将克隆自山菠菜（Atriplex hortensis）的AhCMO导入泗棉3号棉花，盐胁迫试验结果表明，转AhCMO的棉花耐盐性显著优于对照组棉株，说明AhCMO提高了转基因棉花对盐胁迫的耐受性。大肠杆菌的betA编码的胆碱脱氢酶（choline dehydrogenase，CDH）兼具有胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶的功能。连丽君[22]对转betA鲁棉研19的耐盐研究表明，betA的表达提高了转基因棉花叶片中甘氨酸甜菜碱（glycinebetaioe，GB）的累积量，转基因棉花的耐盐能力明显提高。樊文菊[23]对转ZmPLC1棉花和聚合ZmPLC1/betA棉花的耐盐性进行初步研究，通过水培、沙培和东营盐碱地种植，发现转ZmPLC1棉花的耐盐性高于野生型对照，转betA和ZmPLC1的聚合转基因植株，籽棉产量显著高于转ZmPLC1棉花、转betA棉花和野生型对照，以上工作表明，转ZmPLC1单个基因可以在一定程度上提高棉花的耐盐性，且聚合betA和ZmPLC1 2个基因后，棉花的耐盐性又进一步提高。因此，可以通过基因聚合的方法提高植物的耐盐性，为培育耐盐棉花新品种提供新的种质资源，也为研究多个耐盐基因相互作用及其调控机制提供新的试验材料。陈翠霞等[24]利用花粉管通道技术将耐盐碱的罗布麻（Apocynum venetum）DNA导入鲁棉6号，从后代中筛选出棉花耐盐变异体山农011，对山农011及其杂种后代进行了抗盐遗传和基因效应分析，结果表明，变异体的耐盐性是由核基因控制的，其遗传基因效应以加性效应为主，并存在较大的加性互作效应。该耐盐变异体可作为一良好的抗盐种质材料利用。李雪林[25]通过过表达对逆境起调控作用的转录因子基因SNAC1，系统地对转基因棉花植株进行抗逆性分析和鉴定，验证了SNAC1是具有耐旱及耐盐的转录因子基因。中国农业科学院生物技术研究所郭三堆课题组将具有自主知识产权的耐盐碱关键基因GhABF2（专利号：ZL200910158311.X）导入中国棉花主栽品种苏棉12号，创制出耐盐碱转基因棉花新品系8个，进入中间试验阶段。经过连续3年分别在山东、新疆两地进行的耐盐碱试验鉴定，获得4个综合农艺性状优良、耐盐碱性能突出的转基因棉花新品系[26]。在0.40%—
0.45%的盐碱条件下，受体棉花品种苏棉12出苗率只有32%，转GhABF2棉花新品系出苗率高达65%，单株结铃比受体增加3—4个，最终两者产量分别比其受体对照增加33%以上，具有较大的盐碱地生产应用潜力，该课题组还通过农杆菌介导棉花下胚轴遗传转化方法，将溶菌酶hel（抗病）、CP4-EPSPS（抗除草剂）和Na+/H+逆向转运蛋白基因（NhaD k3）同时导入棉花模式受体R15中，再生植物经过连续3代自交后，经抗草甘膦、抗棉花黄萎病及耐盐碱能力筛选，得到高抗棉花黄萎病、抗除草剂草甘膦及具一定耐盐碱能力的转基因棉花新品系T58-22。 1.3 抗除草剂转基因棉花
草害是影响棉花生产的主要因素之一，棉田杂草种类严重影响棉花的生长。除草剂和抗除草剂棉花的协同使用是棉田杂草防除的重要对策。目前，抗除草剂主要有2种策略：一是引入降解除草剂的酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其分解。二是修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感或促使其过量表达以使作物吸收除草剂后仍能正常代谢。中国科学家针对这两种策略均做了大量研究[27]。
1.3.1 抗草甘膦 草甘膦（glyphosate）是世界上使用最广泛的一种非选择性内吸传导有机膦类除草剂。其机理是竞争性抑制植株中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPs）的活性，阻断芳香族氨基酸的合成，造成芳香族氨基酸缺乏，导致植株死亡。国内对抗草甘膦的基因进行了大量研究，取得了很多可喜的进展。
雷凯健等[28]2006年从土壤总DNA中克隆到草甘膦N-乙酸转移酶基因，并对其表达蛋白的酶学特性进行了分析，为其在抗草甘膦转基因作物中的应用积累了理论依据。何鸣等[29]通过对鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌的EPSP合成酶基因多位点突变，克隆了突变的aroA，并使之在大肠杆菌中得到表达。赵特[30]从严重草甘膦污染的土壤中分离出一株高抗草甘膦的假单胞杆菌菌株，克隆到与EPSPS同源的G6基因，将其转化水稻进行功能验证，发现该基因具有一定的抗草甘膦活性。朱玉[31]从长期污染草甘膦的土壤中分离到一株草甘膦高耐受性荧光假单胞菌G2菌株，从中克隆到的epsps不含国外公司专利保护的保守序列和突变位点，显示了良好的开发应用潜力。沙纪莹[32]从斯氏假单胞菌基因组文库中克隆到一个完整的基因，能在草甘膦浓度为150 mmol·L-1的M9液体培养基中良好生长，该基因有望成为培育高抗草甘膦转基因作物
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的基因材料。刘柱[33]从被草甘膦极度污染的土壤中分离到一株极端抗草甘膦菌HTG7，该菌株能在草甘膦浓度为900 mmol·L-1的Mops限制性培养基上生长。从中克隆到全长1 350 bp、编码EPSP合酶的基因。该EPSP合酶基因与之前报道的aroA在核苷酸水平几乎没有任何同源性，蛋白序列与22种已报道的微生物来源的EPSP合酶的同源性也在46%以下。并通过错误倾向PCR方法，找到了该EPSP合酶的关键活性位点，为培育具有中国自主产权的转基因抗草甘膦作物提供的基因资源。童旭宏等[34]从陆地棉中克隆到EPSPS，对该基因进行了组织特异性表达分析，为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。程海刚等[35]从棉田间的杂草青麻中克隆到epsps，通过转化酵母证明所获得的epsps具有生物学功能。之后，中国农业科学院生物技术研究所郭三堆课题组将该基因转化棉花，筛选出具有良好草甘膦抗性的棉花植株。此外郭三堆课题组还和中国农业科学院生物技术研究所林敏课题组合作，将林敏课题组从极端抗草甘膦微生物中克隆到的抗草甘膦新型EPSP合酶GR79及N-乙酰转移酶GAT进行了密码子改造和基因结构优化，通过转化烟草和棉花，初步验证了抗草甘膦基因的抗性，并获得了对草甘膦有较强抗性的双价抗草甘膦转基因棉花材料[36-37]。
1.3.2 抗其他除草剂 除草剂2,4-D类似植物生长素，前人从土壤细菌Alcaligene eutrophus分离到tfda，该基因编码的2,4-D单氧化酶能将2,4-D降解为2,4-二氧苯酚，其降解产物对植物的毒性比2,4-D小100倍，山西省棉花研究所陈志贤等与澳大利亚CSIRO及中国农业科学院生物技术中心合作，将tfda导入晋棉7号、冀合321等棉花品种，对其后代进行田间抗药性鉴定表明转基因系对2,4-D的耐受性超过了大田使用浓度[38]。中国农业科学院棉花研究所与中国科学院上海植物生理研究所合作，将除草剂草丁膦的bar导入棉花主栽品种，取得了阶段性成果[39]。张磊[40]通过精细定位，从水稻中克隆到bel，该基因可对苯达松和磺酰脲类除草剂产生抗性。溴苯腈（bromoxyril）是除草剂buctril的活性成分，其作用机理是抑制光合作用的电子传递。张金文等[41]2006年从克雷伯氏臭鼻杆菌中克隆到编码腈水解酶基因bxn，通过在大肠杆菌中表达，证明其可将溴苯腈降解为无毒物质。乙酰乳酸合成酶（ALS，EC2.2.1.6）在细菌、酵母和植物中催化支链氨基酸的生物合成，它是磺酰脲类除草剂的作
用靶标。宋贵生等[42]2007年从水稻中克隆了als，转化烟草后发现转基因植株和对照烟草相比其除草剂抗性高达50 mg·L-1。
卢宗志等[43]2009年从杂草雨久花中克隆到als，研究表明抗药性雨久花对除草剂苄嘧磺的抗性可能与其第197位的突变相关。 1.4 抗病转基因棉花
棉花病害是影响棉花生产的主要因素之一，目前 困扰中国棉花产业的主要病害是黄萎病，棉花黄萎病是黄萎病菌经土壤传播、侵染到棉花植株最终引发维管束疾病的一种真菌性病害，具有危害严重、分布范围大、寄主种类多及存活时间长等特点，可造成棉花大量减产甚至绝收，被形象地称为棉花的“癌症”。针对以黄萎病为代表的主要病害，采用传统的防治手段，如通过传统育种的方法培育抗病品种、农药防治等方法收效甚微，而且存在培育周期长，严重污染环境等问题，因此，近年来中国研究人员从生物技术的角度，对抗棉花黄萎病基因开展了大量的研究，并取得了重要进展。
高巍[44]以海岛棉品种海7124作为研究材料，通过比较蛋白质组学的方法，一共得到188个在海7124根系中受黄萎病菌侵染后与水处理的平行对照相比表达量出现差异的蛋白，这些蛋白共同参与了棉花对黄萎病菌入侵的响应。徐理[45]分别构建了抗黄萎病的海岛棉海7124接种黄萎病菌后的抑制差减杂交cDNA文库以及通过大规模测序的RNA-Seq技术研究棉花抗黄萎病机制，通过基因表达分析，获得了大批棉花抗黄萎病相关基因，并对其中的一个WRKY类转录因子进行了较为详细的功能。孟宪鹏[46]克隆得到2个海岛棉ERF转录因子基因，将其转化植物后对其抗病相关功能进行研究，结果表明，在转基因烟草中，海岛棉ERF转录因子可以增强烟草PR基因的表达；在转基因棉花中，可以增强几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因和PR基因等棉花抗病相关基因的表达。由此推测，将海岛棉ERF基因转入棉花超表达后能够高效激活下游抗病相关基因的表达。通过对已得到的转基因棉花部分幼苗进行黄萎病菌侵染后发现：T0转EREB1棉花幼苗的耐病能力高于对照。通过上述研究可知：海岛棉ERF族基因的新成员EREB1/2在调控抗病相关基因表达方面具有重要作用，EREB1/2在转基因烟草和棉花中超表达后可有效增强植株体内抗病相关基因的表达，从而提高了转基因植株的抗病能力。张文蔚[47]以陆地棉高抗黄萎病新品系中植棉KV1为材料，接种大丽轮枝菌强致病力落叶型菌株V991后