17期 郭三堆等：中国转基因棉花研发应用二十年 3377
0—96 h棉株幼根总RNA，构建正、反向抑制差减杂交文库，筛选到147个信号强度差异明显的克隆，建立了黄萎病菌侵染初期陆地棉的抗病相关基因表达谱，并证明了GhUbI1、GhEG和GhSCF在陆地棉抗黄萎病的过程中起重要作用。赵付安[48]采用SSH技术从转录组水平探讨了陆地棉基因的差异表达，采用2-DE技术从蛋白质组水平探讨了栽培棉近缘野生种瑟伯氏棉的蛋白差异表达，并以此为基础克隆了2个陆地棉结构抗性基因GhDIR和GhSUMO，克隆了瑟伯氏棉根的GPIP，克隆了瑟伯氏棉根的4个TIR-NBS- LRR类抗病基因类似物，这七个基因的克隆为进一步研究其抗病功能奠定了基础。倪萌等[49]采用叶片针刺接种法从细胞学方面分析转hpa1xoo棉花与棉花黄萎病菌互作产生的微过敏抗病反应，通过细胞显微观察表明，转hpa1xoo棉花T-34与非转基因棉花在抗病性表型方面存在明显差异，转hpa1xoo棉花较非转基因棉花有较强的抗病性。 1.5 纤维品质改良转基因棉花
棉纤维是棉花产量形成的主要部分，其品质决定经济价值。在生产实践中，高产棉花不优质、优质棉花不高产是限制棉花种植业发展的主要因素之一。随着纺织工业的不断发展，对棉花纤维品质不断提出新的要求，传统的遗传育种技术已经不能解决生产实践中关于棉花产量和品质之间存在的矛盾。利用基因工程技术将棉花纤维发育相关基因导入棉花，提高棉花纤维产量和品质，成为当前棉花增产和品质改良的主要途径。同时，随着高通量基因克隆和表达分析技术的不断发展，大量与棉花纤维产量和品质相关基因和表达调控元件得到了验证，并初步应用于棉花。
据报道，棉花纤维增产基因主要与棉花种子发育和IAA等激素代谢相关。李德谋等[50]将GhASN-Like导入棉花，提高了转基因植株的单株成铃数和单铃种子数，增加了籽棉和皮棉的产量。裴炎等[51]利用棉花纤维细胞特异启动子FBP7，驱动IAA合成基因iaaM在棉花中表达。使在棉纤维发育起始阶段，胚珠表面的IAA含量迅速增高，增加了能够发育成纤维的细胞数量。经过连续4年测产，转基因棉花纤维产量比对照提高了15%以上[52]。
棉花纤维品质与纺织工业的应用密切相关，主要涉及了棉纤维长度、细度、强度、色泽等指标。目前，利用基因工程技术将调控棉花纤维发育的相关基因导入棉花来提高棉花纤维品质，已经取得了初步的进展。李文彬等[53]利用棉花纤维特异启动子驱动吲哚双加
氧酶（bec）基因在棉花中表达，使转基因棉花纤维获得了特殊的颜色。左开井等[54]将GbAnn9导入棉花，转基因棉花纤维长度比对照材料增加2—3.5 mm，纤维强度增加0.3—3.3CN/tex。夏桂先等[55]将棉花苯丙烷类化合物木质素合成基因GhLIN2导入棉花，增加转基因棉花纤维内木质素含量，使棉花纤维长度、细度和强度均得到显著提高。李晓荣等[56]利用35S启动子驱动棉花尿甘二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因GhUGP1在棉花中表达，获得的转基因棉花材料纤维长度比对照增加18.5%，断裂比强度增加31.85%。
此外，通过对棉花纤维细胞发育机理的简析，分离获得了多个与棉花纤维品质相关的候选基因。刘进元等[57]克隆获得棉花纤维可逆糖基化蛋白酶基因，该基因可以通过控制棉纤维中多糖物质的积累，进一步提高棉纤维的品质。李学宝等[58]克隆获得棉花纤维特异表达的水孔蛋白家族基因GhPIP2;6，其转录产物主要在伸长期的棉花纤维中高表达，通过在酵母中表达研究发现可以使细胞长度增加1.3—1.47倍。朱玉贤等[59]克隆获得与棉花纤维伸长密切相关的β微管蛋白基因，该基因在棉花纤维伸长期高表达与棉纤维长度发育密切相关。
为了能够实现棉花纤维发育相关基因的精确定位表达，在棉纤维特异表达启动子方面的研究也取得了重要的进展。郭三堆等[60]分离获得了一个在棉花生殖器官优势表达的启动子Arf1，该启动子为棉花腺苷酸核糖基化作用因子基因的启动子。与报告基因GUS融合后，利用花粉管通道法转化棉花，报告基因在转基因棉花的生殖器官高表达。张献龙等[61]克隆获得了棉花纤维特高效表达的类成束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白基因（GhFLA1）启动子，该启动子能够驱动GUS报告基因在棉花纤维发育0—20 d高表达。
1.6 其他性状如早衰、耐涝以及特殊用途等转基因棉
花
目前，生产应用的高产、优质棉花品种均具有早衰的特征，限制了高产、优质棉花品种的推广应用。利用基因工程技术延缓棉花的生长发育过程中的早衰现象，对具有早衰特性的棉花高产品种的培育和推广应用具有重要意义。李静等[62]克隆获得了异戊烯基转移酶基因ipt，该基因编码的蛋白是细胞分裂素生物合成途径中的关键酶。将该基因导入早衰型陆地棉品种中棉所10号中，通过对转基因棉花进行叶绿素和细胞分裂素含量的测定及形态观察，发现转基因棉花的早衰性状得到延迟。
3378 中 国 农 业 科 学 48卷
在中国南方湿度大或者雨水多的地方，由于棉花不耐湿和涝的特性，雨季来临时会引起棉花大量落铃导致减产，限制了棉花种植业的发展。利用基因工程技术将耐涝基因导入棉花，培育耐涝棉花新材料，不仅可以保证棉花稳产高产，而且可以通过将其他地区不耐涝的棉花培育为耐涝材料，为遗传育种提供更加丰富的资源材料。中国农业科学院生物技术研究所作物分子育种课题组将来源于透明颤菌血红蛋白基因（vgb）经过密码子优化设计后导入棉花，培育出高耐涝的转基因棉花新材料，该材料在地下部分封闭的涝池内表现良好，比对照材料增产20%以上[63]。
上述不同类型转基因棉花的获得，极大地丰富了中国的棉花种质资源，促进了中国棉花的育种研究。
2 棉花的遗传转化方法
遗传转化方法是进行基因功能分析和改良作物性状的必要手段。主要的植物遗传转化技术可分为两大类：第一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，以基因枪转化法和花粉管通道法为代表。第二类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导等转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于单、双子叶植物的遗传转化。随着科学技术的不断发展，近年来，逐渐发展了一些新的转化技术，如茎尖或芽尖转化法，农杆菌菌液浸染法以及纳米载体花粉介导法等。这些转化方法的兴起及广泛应用对转基因育种具有重要意义，极大地加快了农作物改良以及新品种选育的步伐。 2.1 农杆菌介导转化法
农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有很多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌为根癌农杆菌。根癌农杆菌含有一种Ti质粒，Ti质粒上有一DNA片段，称为转移DNA。农杆菌侵染植物时，细菌通过植物伤口进入寄主组织，但细菌本身不进入寄主植物细胞，只是把Ti质粒的T-DNA片段导入植物的基因组中，并得以表达，从而导致冠瘿瘤的发生，并且导入的T-DNA在转化植株后代中通常表现出典型的孟德尔遗传规律。由于Ti质粒本身能插入大约50 kb的DNA外源基因，因此，利用这种转化载体，将Ti质粒上致瘤的有害基因切除，代之以有益的外源基因，使得向植物细胞引入外
源基因已成为植物基因工程研究的一项常规技术。棉花农杆菌介导转化一般是采用叶盘法。国外最早利用此法的是Agracetus公司，将NPTII 和CAT导入柯字棉312中获得转基因再生棉株。国内最早的是山西省农业科学院棉花研究所生物技术研究室陈志贤等，将除草剂基因Tfda导入晋棉7号获得转基因再生棉株。目前，中国农业科学院生物研究所、中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国科学院微生物研究所与各地方农业科学院合作，利用农杆菌介导法将抗棉铃虫和抗蚜虫的单价、双价及三价等目的基因导入棉花，获得单价、双价和三价转基因抗虫棉花新品种。 2.2 基因枪轰击转化法
基因枪是20世纪80年代初由Sanford等发明。该技术原理是：利用基因枪产生的高压动力冲击波将包裹外源DNA的重金属颗粒（如钨粉、金粉等）射穿植物细胞壁和细胞膜，射入植物细胞，是外源DNA随机整合到植物细胞染色体中，达到外源DNA在受体植物中正常表达和稳定遗传的目的。经过10多年的改进和提高，基因枪技术已成功应用在烟草、水稻、小麦、棉花、大豆等许多农作物的品种改良上，并且该技术被用于瞬时表达研究和培育稳定的转基因植物等研究领域[64-67]。
2.3 花粉管通道介导转化法
20世纪70年代末期，在DNA片段杂交假设理论和对植物开花受精过程的解剖学及细胞学特征研究的基础上，中国科学家周光宇等推测外源DNA可以通过花粉管经过的珠心通道进入受精胚囊，转化进入精卵融合细胞、早期合子及早期胚细胞。随后，建立花粉管通道技术并通过该技术将外源DNA导入陆地棉，成功培育出抗枯萎病的新品种。1993年，中国农业科学院生物技术研究所与江苏农业科学院经济作物研究所合作，利用花粉管通道法在国内首次将GFM Cry1A杀虫蛋白基因导入棉花，培育出转基因抗虫棉花植株。花粉管通道法具有操作简单、对受体植物以及外源DNA无特别要求、无组织培养过程、转化速度较快、育种周期较短等特点，目前，该方法已成功应用于棉花、水稻、小麦、大豆等农作物的改良和育种工作[68-71]。 2.4 茎尖或芽尖转化法
传统的农杆菌介导法受体主要是幼胚和胚性愈伤组织，受体的基因型决定着遗传转化的成功与否；而愈伤组织形成的再生植株具有无性系变异大、周期长等不利因素。因此，选择合适的外植体作为农杆菌转化的受体、建立不受基因型限制、快速而又高效的遗
17期 郭三堆等：中国转基因棉花研发应用二十年 3379
传转化体系是转基因生物技术研究者的目标。茎尖培养是植物组织的常规技术，已被广泛应用。目前，幼胚仍然是转化受体系统中最重要的外植体。而由成熟胚茎尖分生组织诱导而来的丛生芽与传统的幼胚相比，具有不受季节限制，诱导率高，再生植株变异少等优势。通过改善茎尖的遗传转化，利用农杆菌介导法转化棉花、玉米等农作物的茎尖，缩短转化周期，从而获得阳性转基因植物的方法称为茎尖/芽尖转化法。与传统的幼胚及其胚性愈伤组织为受体的遗传转化体系相比，此种方法具有简单、快速、工作效率高和试验周期短等优点；与基因枪法相比更加经济适用；与合子转化相比，取材不受季节限制。但该方法的缺点是获得的转基因后代嵌合体较多，得到纯合稳定的转基因品系困难较大[72]。 2.5 农杆菌液浸染法
大多数的转化方法都需要组织培养技术，通过组织培养技术进行单细胞的选择并再生出整个植株虽然减少了嵌合体的出现，但是由于后生影响和染色体重排就会出现体细胞无性系变异。利用农杆菌液浸染植物组织（多数研究都采用花器官）的方法进行转基因，其特点是避免了组织培养和再生过程。前人的研究表明，浸花得到的T0种子是典型的杂合子，在同一插入位点只有2个等位基因中的一个[73-74]。大量的结果表明转化发生在花发育的后期[75]。尽管浸花的方法有较高的转化率，但对于转化的细胞和转化的时间仍然不太清楚。
2.6 纳米载体花粉介导转化法
随着20世纪末纳米科技的兴起，纳米材料以其特殊的表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应及良好的生物学特性，在生物学领域得到了成功地应用，尤其为制备高效、靶向的基因载体系统提供了良好的介质。自从20世纪60年代末发现二乙基氨乙基葡聚糖/DNA复合物能介导基因传递后[76]，纳米材料作为基因载体的研究不断深入。
纳米基因载体在动物和人的细胞转染试验中已经取得了成功[77-78]。并显示出巨大的应用前景。纳米载体在植物的遗传转化方面与裸DNA分子相比，具有更高的转导率和基因表达率。日本大阪大学的Takefumi等[79]以钙盐粒子微球为基因载体，将质粒DNA囊括在微球内部，对BY-2烟草细胞原生质体进行转染，试验结果显示其转染率是裸DNA分子转染效率的10倍。美国爱荷华州立大学的Torney等[76]利用蜂窝状介孔二氧化硅纳米粒子为载体，装载基因及
刺激该基因表达的化学物质，使用金纳米粒子覆盖介空表面，穿过植物细胞壁，同时将两者置入植物细胞中，并控制在适当的时间和地点释放，成功获得转基因植株。采用纳米载体基因技术改良花粉管通道法，有可能大幅度地提高外源基因在花粉管通道法中的传输、保护外源基因在传输和转导过程中免受DNA酶的降低，提高遗传转化效率，为棉花等转基因作物新品种培育提供了更为简便、高效的分子育种新技术。
目前，虽然纳米载体在植物遗传转化上的应用时间还较短，仍存在许多尚待解决的问题，但与其他植物基因转化载体相比，纳米载体技术具备生物相容性好、稳定性高、具有浓缩及保护DNA的作用、装载容量较大、优良的表面性质、无遗传毒性和免疫原性、制备简单等方面的优势，并且通过不同材料和工艺，能制备出各种各样具有“特异功能”的载体。这种材料并不昂贵，能使纳米载体更具市场竞争力，因此，纳米载体转基因技术必将成为今后植物转基因技术的有效途径之一。
3 转基因植物安全性评价
一系列具有优良性状（如抗虫、抗除草剂等）的转基因作物新品种的大面积推广种植在带来直接经济与生态效益的同时，也为解决未来世界粮食、能源危机提供了新的途径。但同时，转基因技术也存在一定的风险。近年来，转基因生物安全问题在全世界范围内引起了广泛关注。目前对转基因植物的安全性评价主要集中在2个方面，一是环境安全性，另一是食品安全性。
3.1 转基因植物的环境安全性
转基因植物的环境安全性主要涉及3个方面：（1）转基因植物本身可能演变为农田杂草。植物在获得某种特定基因（如抗病、抗虫、抗除草剂和抗逆等），可能会增强其生存竞争性，在生长势、越冬性、耐受性、种子产量等方面强于非转基因植物。若被推广种植，释放到自然环境中的机会特别大。因其具有野生植物没有的各种抗性，将会迅速地成为新的优势种群，进而演变成农田杂草[80]。（2）基因漂流影响其他物种。在自然条件下，栽培作物和栽培作物之间、栽培作物与其近缘野生种之间、栽培作物和杂草之间都可能存在种间基因漂流能力。因此，转基因植物中的一些抗除草剂、杀虫剂和病毒的抗性基因就有可能通过花粉杂交等途径向其同种或近缘野生种转移，
3380 中 国 农 业 科 学 48卷
从而产生出一些可抗除草剂、杀虫剂和病毒的“超级杂草”[81]，造成不可估量的农业损失和生态灾难。（3）影响生物的多样性。植物在引入抗虫或抗病基因后，往往具有较强的“选择优势”，大量的转基因植物进入自然生态系统中，可能会淘汰原来栖息地上的物种及其他遗传资源，加剧品种的单一化，造成生物数量剧减，甚至会使原有物种灭绝。如转入BT杀虫基因的抗虫棉，其目标昆虫是棉铃虫和红铃虫等植物害虫，如大面积和长期种植抗虫棉，昆虫有可能对抗虫棉产生适应性或抗性，这会影响抗虫棉的应用和BT农药制剂的防虫效果。因此，在抗虫棉推广时一般要求种植一定比例的非抗虫棉，以延缓昆虫产生抗性。（4）可能对非目标生物造成危害，在植物基因工程中所用的许多基因是与抗虫或抗病有关的，其直接作用的对象是生物。其插入的抗虫或抗真菌的基因可能对其他非目标生物起作用，从而杀死了环境中有益的昆虫和真菌。美国康奈尔大学Losey等[82]发现，转基因Bt玉米花粉能导致非目标害虫黑麦金斑蝶（Danaus plexippus L.）幼虫死亡。 3.2 转基因植物的食品安全性
转基因食品又称基因修饰食品（genetically modified food，GMF），即用转基因生物制造或产生的食品。进行转基因食品安全评价时，应从宿主、载体、插入基因、重组DNA、基因表达产物及其对食品营养成分的影响等方面来考虑。评价内容主要包括4个部分，第一部分是基本情况：包括供体与受体生物的食用安全情况、基因操作、引入或修饰性状和特性的叙述、实际插入或删除序列的资料、目的基因与载体构建的图谱及其安全性、载体中插
入区域各片段的资料、转基因方法、插入序列表达的资料等；第二部分是营养学评价：包括主要营养成分和抗营养因子的分析；第三部分是毒理学评价：包括急性毒性试验、亚慢性毒性试验等；第四部分是过敏性评价，主要依据联合国粮农组织与世界卫生组织提出的过敏源评价决策树依次评价，禁止转 入已知过敏源。
中国农业科学院生物技术研究所与江苏省农业科学院经济作物研究所、山西省运城棉花研究所、石家庄市农业科学院、中国农业科学院棉花研究所等多家育种单位合作，将构建成功的含有自主知识产权的抗虫基因植物表达载体采用花粉管通道技术和农杆菌介导法进行遗传转化，经过后代分子鉴定、室内生测后，育成了一批转基因抗虫棉品种，为以后国内转基因抗虫棉品种的培育提供了特异的种质资源，也为国内抗虫棉的迅猛发展提供了动力。
为了加强农业转基因生物安全管理，保障人类健康和动植物、微生物安全，保护生态环境，促进农业转基因生物技术研究，农业部陆续出台了多个条例、办法和公告，来规范转基因抗虫棉的田间释放和产业化。
自1996年开始转基因抗虫棉安全性评价申报以来，至2013年共计申报并通过生产应用的安全性评价2 016份，从图1中可以看出，随着安全性评价内容的完善、管理规范化，从2004年农业部简化了转基因抗虫棉安全评价的申报程序以后，获得的安全证书的数量急剧上升，基本上每年审批的证书数量都在150份以上（图1）。
拥有中国基因知识产权的转基因抗虫棉安全性评价共计1 955份，其中，转Cry1Ab/cry1Ac棉花1 391
数量 Number
图1 2002—2013年转基因抗虫棉获得生产应用的安全证书
Fig. 1 The safety certificate of transgenic insect-resistant cotton with the production in 2002-2013
17期 郭三堆等：中国转基因棉花研发应用二十年 3381
份，占总安全性评价2 016份的69.00%，转Cry1Ab/ cry1Ac+CpTI棉花553份，占27.40%，转Cry1Ac+API棉花11份，占0.55%；美国孟山都公司申请并通过转cry1Ac抗虫棉安全评价61份，占3.05%。
总之，自1996年国产抗虫棉进入田间试验，各省棉花育种相关单位利用抗虫棉种质资源开始大规模以来，中国抗虫棉的研究及产业化取得了迅速的发展，国产抗虫棉的种植面积逐渐增加。国产转基因抗虫棉的应用经历了近20年的风风雨雨，为中国棉花产业的发展和改善生态环境作出了巨大贡献。而中国转基因抗虫棉安全性评价为转基因抗虫棉的生产应用起到了保驾护航的作用。
目前，转基因作物的安全性评价技术与政策保障体系已经建立，今后还应该加大转基因棉花安全生产应用保驾护航作用的力度，大力发展中国转基因植物分子育种高新技术，为迅速占领高新技术制高点、提高中国转基因植物分子育种的国际竞争力再作新贡献。
4 转基因抗虫棉的品种培育及推广
4.1 抗虫棉品种审定情况
中国审定的第一个转基因抗虫棉品种是美国岱字棉公司的新棉33B，该品种于1997年由河北省审定，审定编号为冀审棉97001号，1997—2006年美国岱字棉公司与孟山都公司先后在河北省、河南省、山东省、安徽省、湖北省和湖南省审定了7个转基因抗虫棉品种，在2003年以前无论从品种数量还是种植面积都占抗虫棉的统治地位。中国从1998年开始审定了第一批转单价抗虫基因国产转基因抗虫棉品种，如：GK12、晋棉26和GKZ1（国抗杂一号），1999年审定了第一个国审抗虫棉品种中棉所38，从此迈开了中国转基因棉花品种培育和生产推广的步伐[83]。截至到2013年，中国共通过了134个国审转基因抗虫棉品种，黄河流域审定96个，长江流域审定36个，西北内陆棉区审定了2个，其中以生产需求量最大的中熟品种为主，有生育期少于110 d的早熟品种7个，彩色棉品种1个[84]。目前，中国抗虫棉已经形成了覆盖所有棉区、不同熟期不同类型搭配合理、常规棉与杂交棉并重的品种体系。
4.2 抗虫棉品种发展的趋势及存在的问题
4.2.1 杂交品种比例越来越大 1999—2013年，134个国审品种中有88个杂交品种，2006年以前只有23个杂交品种，2007—2013年共审定了65个杂交品种。其中，长江流域36个品种中只有1个常规品种，杂交
品种有35个，从以上的数据可以看出，黄河流域棉区以常规种和杂交种并重，长江流域棉区以杂交种为主[85]。 4.2.2 品种存在多、乱、杂现象 1996—2012年，转基因抗虫棉的品种数量在逐年增加，截至到2012年，内陆棉区种植面积超过0.33万公顷的棉花品种品系一共有245个，其中黄河流域有166个，长江流域品种有79个[86]，这里面有国审、省审品种，还有些没有审定的品系。品种的多样性满足了不同中国气候类型耕作制度的需求，但同时也存在品种同质化品种多，突破性品种少的问题。因此造成了有些抗虫棉品种审定后没有推广几年就被淘汰的现象，品种更替过于频繁，造成人力物力的浪费。
4.2.3 品种的产量性状不断提升，但纤维品质性状改进不大 随着抗虫棉品种的发展，棉花单产不断提高，在中国棉花面积没有增加的情况下，产量有了大幅度提高[87]。但是与纤维品质相关的性状改进不明显，特别是棉纤维的长度和比强满足不了今后棉花机采作业和纺织行业技术更新的需求。有待今后抗虫棉育种单位进行选育方向的调整[88]。 4.3 转基因抗虫棉的产业化
4.3.1 抗虫棉的推广面积 从1997年转基因抗虫棉开始大面积种植，主要是以美国的品种为主，当时占国内抗虫棉市场份额的95%以上，国产抗虫棉份额不到5%。随着中国自主研发的转基因抗虫棉逐渐成熟，国产抗虫棉的品种数量和种植面积逐年提高，2001年转基因抗虫棉的面积首次超过了非转基因棉面积。之后国产抗虫棉的数量和推广面积都迅猛增长，2002年国产抗虫棉占国内抗虫棉市场份额的43.3%，2003年国产抗虫棉的面积超过了美国抗虫棉面积，占国内抗虫棉市场份额的53.9%，到2007年，国产抗虫棉面积已占96.1%，1998—2013年国产抗虫棉累计推广面积超过3 000万公顷，打破了美国抗虫棉的垄断，成功地保护了中国棉花产业及相关产业和民族利益[89]。 4.3.2 抗虫棉产业化对中国棉种行业产生了深远的影响 抗虫棉在中国市场零售价为37.2元/kg，改变了非抗虫棉种8.2元/kg的低价局面，为提升棉种质量，改进棉种生产和销售方式提供了可能。由于棉种利润的增加，催生了一批专业从事棉种或以棉种为主营业务育繁推一体化的公司。在抗虫棉的品种选育方面也逐渐由科研单位、大专院校为主向育繁推一体化的种业公司和民营研究所转变。使得抗虫棉品种的选育更贴近市场的需求，加快了品种选育和推广的步伐，使中国棉种行业走上了一条良性循环的道路[90]。