家蚕主要经济性状功能基因组与分子改良研究 - 图文(2)

1．总体研究思路 本项目的总体思路是：将家蚕全基因组工作框架图、家蚕功能基因注释信息和家蚕资源作为整个项目的基本出发点，综合运用基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学和分子生物学的方法和技术，通过从框架图到精细图谱到基因定位研究和从基因到功能到相互作用研究，克隆家蚕丝蛋白合成、性别、免疫和发育变态的关键基因，鉴定其功能，阐明其主要机理。通过从基因到素材创新研究，实现重要经济性状的遗传调节和改造，奠定产业实际应用的基础。 2．技术路线 针对不同的目标基因，制定不同的技术路线：对于丝蛋白合成和抗性相关基因，由于研究重点在基因的相互作用和机理，因此主要技术路线是通过比较基因组学和生物信息鉴定网络中的关键节点基因，通过基因的调控领域分析研究基因的相互作用。而对于性别决定和发育变态相关基因，重点是实现人为干预和遗传调控，因此主要技术路线是通过基因表达特征和功能研究，确定符合调控要求的目标靶基因。 基因的功能鉴定是整个项目的关键，总体上将利用基因表达谱分析、蛋白质组学、转基因和基因干涉等技术，对相关数据进行综合分析，以提高分析效率。具体采用以下三条技术路线： （1）在已有工作基础上，从家蚕基因结构信息的解析到基因表达特性分析。将主要通过对家蚕基因组信息的深层次分析研究，结合cDNA文库的构建、大规模EST测序和基因表达分析，达到研究家蚕功能基因的结构信息和表达特征目的。 （2）利用蛋白质组、遗传图谱和转基因等基因功能的高效研究手段，准确地分析研究目标基因的功能。 （3）从我国丰富的家蚕遗传资源的分析到重要家蚕功能基因的分离，包括两个主要方面：一是对基因转录的时空特异性进行分析，研究功能基因表达与家蚕发育变态、性别和品质形成的关系；二是通过家蚕物理图谱、分子图谱的构建，利用家蚕重要遗传突变体和近等位基因系，定位克隆家蚕重要功能基因。充分利用近缘昆虫如果蝇的基因组信息，通过比较基因组研究也是本研究技术路线的重要组成部分。 总体技术路线示意如下： 蛋白质产物 鳞翅目害虫 特异基因 产业技术进步 生物医药 比较基因组 素材创新 生物工厂 基因功能与性状的遗传机理 基因相互作用 转基因、干涉 丝蛋白合成、性别、免疫与发育功能基因克隆 遗传资源 框架图 遗传图谱 整合图谱 精细图谱 3．创新性 （1）本项目不仅是家蚕，也是鳞翅目昆虫领域基因组的第一个重大科技行动。项目基于我国的特殊资源优势和强大产业需求，将家蚕重要功能基因和其产业应用作为主要目标，因此与国际家蚕基因组和功能基因组研究计划相比，更加注重产业化应用导向。项目所重点涉及的家蚕性别决定、发育和变态、重要经济性状形成的分子机理研究等内容，在理论上属于前沿和开拓性课题，应用上切中我国蚕丝业质量和效益要害，因此与蚕丝产业技术传统研究相比，具有理论上的先进性和技术方案的高效性。项目集中体现了基础研究和应用研究的有机结合。 （2）在研究手段上，本项目有机结合生物信息学、基因组和功能基因组分析技术，以大规模功能基因分析和基因定位分析为基础，高起点、高通量、高效率直接切入家蚕功能基因组的基础和应用研究，即基因发现、功能分析和应用基础研究同步进行，一次到位，体现了学科交叉优势和科学发展的新趋势。 （3）第一次全面融家蚕资源平台、基础研究平台和产业技术开发平台为一体，从基因组信息出发，全面分析参与重要性状形成的可能功能基因目标。研究路线具有全面性和系统性，是解决蛋白质合成、发育变态、免疫和性别等复杂过程的可靠路线。 （4）项目涉及的家蚕丝腺工厂和害虫防治应用内容，具有一定的开拓性。 4．可行性分析 项目承担单位近年来共计完成了家蚕相关研究项目50余项，包括6项“863”计划，12项“九〃五”和“十〃五”重大科技攻关项目，2项国家自然科学基金重点项目和35项面上项目，完成了项目的基础积累。在工作保障方面，先后召开了多次全国性家蚕功能基因组讨论会，初步整合了我国功能基因组学和家蚕研究两方面的优势力量，形成了有效的协作组织，各成员单位均开展了具体的前期研究。如中科院将家蚕基因组研究作为第二期知识创新项目启动，投入200余万元用于家蚕微卫星图谱构建和功能基因定位克隆研究；西南农业大学建成了世界规模最大的家蚕资源库，通过承担并完成与本项目相关的“973”预研任务，完成了家蚕功能基因组研究的重要基础性工作，所取得的研究成果在国际上产生了重要影响，为本项目的开展开辟了良好的国际合作空间。特别重要的是，重庆市政府已决定集中投入2000万元，用于建设高水平的蚕桑学重点实验室，形成一个开放的家蚕功能基因组研究平台，全面支撑本项目的开展。因此，通过立项，集成优势，紧密合作，我们完全可以在家蚕基因组研究上做出十分出色的成绩，为丝绸之路增添异彩，为民族产业的发展做出历史性贡献。 5. 课题设臵 按总体研究目标和思路，将本项目分解为5个课题进行，具体目标和主要研究内容如下： 课题1、家蚕基因组图谱整合与基因定位研究 研究目的：利用目前所取得的家蚕基因组序列和图谱信息，在框架图的基础上构建家蚕全基因组精细图；整合家蚕基因组图谱和分子连锁图谱，将序列信息定位到染色体和连锁群；建立家蚕基因定位理论和技术体系，定位克隆重要的突变基因。 主要研究内容： （1）家蚕全基因组精细图谱 综合现有信息，拼接、组装并重新注释家蚕全基因组，利用物理图谱将基因组序列的绝大部分定位在染色体（连锁群）上，发表家蚕全基因组精细图谱。 目前家蚕基因组框架图覆盖深度是6X，覆盖率为95%。因此，本课题的首要任务是：进一步增加覆盖深度和广度，使家蚕基因组序列图谱达到9X以上，覆盖率达到99%以上的精细图标准。家蚕染色体数为28对，其中雌为ZW，雄为ZZ型，为了使初期构建的图谱均匀覆盖所有的染色体，框架图的构建采用了雄个体，不包括28对染色体中的雌性染色体（W染色体）。经典遗传研究证明，W染色体上的雌性决定因子Fem是家蚕性别调控的初始信号因子，对性别起决定性的作用。因此，本课题将在精细图谱的构建中还将重点解决W染色体的序列问题。 该部分研究将主要通过国际合作的方式，对目前国际组织的所有序列和图谱信息进行统一拼接、组装和注释。通过协商，已经原则同意投入的信息包括6X（中国）和3X（日本）共计9X的霰弹法测序信息，基于BAC克隆的11X物理图谱（日本）和BAC克隆末端序列（中国），近200Mb的BAC全测序信息（日本），14万条EST序列（中、日）以及2万余条全长cDNA测序（日本）等。以上信息的获得都使用了国际共同参照品种“大造”，所以从现有信息资源的深度和范围来看，在不追加测序工作量的情况下，基本上可以满足构建一张质量比较高的精细图谱的要求。 （2）遗传图谱和物理图谱的整合 家蚕遗传图谱具有十分丰富的研究积累，利用RFLP、RAPD、AFLP等分子标记，已经构建并发表了近十张分子连锁图，包含了近3000个位点。但是，各个图谱之间缺乏联系，信息不能共享，密度和精度也不能满足定位克隆要求。本课题拟利用微卫星SSR标记，建立高密度的分子连锁图谱。构建长插入片段质粒文库，获得可以利用PCR进行扩增的微卫星位点，构建至少含有2000个SSR标记位点的高密度连锁图。 家蚕经典遗传图谱是近100年家蚕遗传和突变研究的主要成就，包含了200个左右有价值的突变基因信息。为实现遗传图谱和基因组图谱整合，课题将利用国际上通用的家蚕“大造”品系和C108品系作为作图亲本，构建含有28个连锁群的家蚕微卫星遗传连锁图。利用已有的形态标记，对家蚕微卫星遗传连锁图与传统的形态标记遗传连锁图进行连锁分析，发表整合图谱。 （3）重要突变基因定位克隆研究 突变基因是研究新基因和新功能最具有价值的资源，但是其克隆分离难度远比有具体产物或作用方式信息的基因大。基于连锁图谱的定位克隆将成为主要的和可行的分离鉴定方法，本部分研究的主要目的，是建立基于家蚕全基因组精细图谱和整合遗传图谱的突变基因定位体系，并定位和分离重要的突变基因。 目前，我们已经建立了多个重要的家蚕突变近等位基因系统，包括家蚕病毒病抵抗突变系（DNV-z和nsd-Z），发育突变系（蛹期延长和致死），丝蛋白质合成突变（丝胶缺乏）等。以此为基础，课题将利用标记体系对上述家蚕突变进行连锁分析，把突变基因定位于整合连锁图谱；获取与性状紧密连锁的分子标记，根据标记和位臵信息，确定突变基因在全基因组图谱上的物理范围；对所确定范围内的所有基因进行信息分析，确定候选基因，并通过功能分析最终克隆分离控制突变性状的基因。 预期目标： 1、总目标 在家蚕基因组框架图，全长cDNA和遗传连锁图的基础上，通过国际合作构建家蚕精细图；构建高密度的家蚕遗传连锁图，实现多种分子标记遗传连锁图的整合，以及经典形态标记连锁图与分子标记遗传连锁图和遗传连锁图与物理图谱的整合；建立完善的家蚕基因定位克隆平台和功能研究平台，为家蚕重要目标基因的定位克隆和功能研究创造条件。 2、五年预期目标 (1)构建家蚕全基因组精细图谱。目前所有家蚕基因组信息资源已经包括了6×（中国）和3×（日本）共计9×的霰弹法测序信息，基于BAC克隆的11×物理图谱和BAC克隆末端序列，近200Mb的BAC全测序信息，14万条EST序列，基于SSR、RFLP和RAPD的遗传连锁图谱共计近3000个分子标记，经典连锁遗传图谱共计200个标记，以及2万余条全长cDNA测序等。通过对这些信息资源的整合，统一拼接组装，增加序列图谱的覆盖，充分利用已有EST和全长cDNA资源，完善基因组注释，进一步增加覆盖深度和广度，使家蚕基因组序列图谱达到9X以上，覆盖率达到99%以上，并与分子连锁遗传图谱和经典遗传图谱进行整合，将绝大部分DNA序列信息定位在染色体（连锁群）上。 (2)实现分子标记与经典形态标记的整合，遗传图谱与物理图谱的整合，建立家蚕重要功能基因定位克隆体系。在已经构建的含有550个微卫星标记遗传连锁图的基础上，提高微卫星标记的密度，使微卫星标记的数量达到1200－1500个；利用微卫星标记共显性的特点，实现不同分子标记之间的整合，建立起目前已有的3000多个有效标记（RAPD, AFLP等）之间的有机联系，以便进一步提高遗传连锁图的遗传标记密度；在微卫星标记和经典形态标记的基础上，实现分子标记遗传连锁图与形态标记遗传连锁图的整合，使每一个分子标记的连锁群上都拥有1－2个形态标记；构建家蚕物理图谱并实现微卫星标记遗传连锁图与物理图谱之间的整合。 (3)重要基因的定位克隆。对家蚕完全不感染性抗浓核病基因DNV-z进行定位克隆，揭示单基因抗病性的主要特点。同时对发育突变系（蛹期延长和致死）基因，丝蛋白质合成突变（丝胶缺乏）基因进行定位克隆并对SAGE研究中发现的10个家蚕特有的蛹期特异基因进行功能研究，以期揭示这些基因在蛹发育过程中的作用。 (4)获基因专利1～2个， 在国内外核心刊物发表论文29～36篇，其中有重要影响的论文6篇以上；培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生20名、博士研究生10名和博士后3名。 建议承担单位： 中科院上海植物生理生态研究所 中科院北京基因组研究所 建议课题负责人： 黄勇平 中科院上海植物生理生态研究所 王 俊 中科院北京基因组研究所 学 术 骨 干： 徐世杰 国家人类基因组南方研究中心 苗雪霞 中科院上海植物生理生态研究所 经 费 比 例： 10% 课题2、家蚕重要经济性状功能基因研究