家蚕主要经济性状功能基因组与分子改良研究 - 图文(3)

研究目的：针对基础理论和产业发展关键问题，分离克隆与性别、抗性、发育和丝蛋白合成等重要经济性状相关的功能基因，阐明这些经济性状的遗传机理。该课题作为项目的核心。 主要研究内容： （1）家蚕性别相关基因的克隆与性别决定机制研究 经典遗传学研究证明，家蚕W染色体上存在着一个雌决定因子Fem，即只要有W染色体的存在，无论Z染色体和常染色体的多寡，个体均发育为雌。除此初始信号之外的下游信号传导机理，则基本不清楚，但推测与果蝇性别决定机制有相当保守的共同点。家蚕基因组大规模测序，使家蚕性别决定机制的研究取得了重要突破：发现了家蚕的dsx基因（Bmdsx），其与果蝇的dsx基因一样，是雌雄分化的开关调节因子，通过该基因不同的拼接方式决定了个体的性别命运。但是，与果蝇dsx不同，Bmdsx基因的欠缺型拼接为雌特异型，而雄型拼接则没有第3、4外显子，由此估计，一个活化的阻遏物参与了该过程的调节。 本研究的主要内容是分离、克隆参与家蚕性别决定的关键功能基因。由于像开关基因Bmdsx那样雌雄特异形式不同的基因并不能成为理想的由雌到雄的调节靶，因此研究重点将是W染色体（Fem）初始信号以下，dsx以上调控过程的关键基因；研究这些基因的表达特征、产物特性和作用方式；特别是寻找以Fem，Bmdsx为主的可以实现性别遗传调节的功能基因，较为详细地阐明家蚕性别决定的主要遗传基础和分子机理；基于获得的功能基因信息，利用RNAi对家蚕性别调控和发育变态关键的基因进行干涉，特异关闭雌发育通道，实现人为调控的目的。 （2）家蚕发育与变态相关功能基因研究 分离、克隆控制家蚕发育变态，重点是从蚕蛹到成虫（蚕蛾）阶段的关键基因，重点研究包括蛹变态期MH诱导下变态发育的分子机制，JH与MH调控下幼虫蜕皮发育的分子机制。鉴定发育调控网络中相关激素信号传导的各种已知和未知的受体因子、转录因子和调控因子，研究它们的结构、功能和相互作用的关系，为最终阐明家蚕幼虫蜕皮与成虫变态发育的级联调控系统奠定基础。研究近缘昆虫如野蚕、柞蚕和蓖麻蚕等蛹期发育突变，探讨基因多态型与变态特征的关系，寻找发育调节的可行途径。利用转基因和基因干涉技术，建立家蚕“永久蛹”系统的技术途径。 （3）家蚕抗微生物肽和抗性相关基因和功能研究 利用生物信息学方法，详细研究所有家蚕抗菌肽基因的结构、所编码蛋白质/多肽、基因组中的分布和构成、系统进化关系、转录前后的调节方式以及可能的调控元件。利用细菌（革兰氏阴性和阳性细菌、真菌）注射血液，对家蚕进行诱导，在mRNA水平上研究各类家蚕天蚕素、抗菌肽、类免疫球蛋白等重要血液抗菌基因在诱导后的表达情况，并在蛋白质水平上检测抗菌肽产物的合成；家蚕幼虫和蛹是抗菌肽基因作用的主要时期，因此，本课题将系统比较各个基因在家蚕这两个时期的作用，系统比较各个基因之间应答的特征，并进行分类。结合防御病原微生物入侵和增殖相关基因的功能研究，利用基因表达分析和RNAi等方法，在个体水平上研究各个免疫相关基因的生物学意义，通过对重要基因进行干涉，研究其干涉后基因产物的消减和家蚕成活的关系，探讨这些基因在家蚕防御中的重要性。 （4）家蚕丝蛋白质高效合成相关基因研究 通过生物信息学的方法，详细检索丝腺基因群的上游调控序列，分析参与丝腺特异表达调控的结构元件的结构、分布、类别和可能的作用方式；将这些基因调控元件与已经发现的茧丝结构基因的调控元件进行比较，探讨它们在决定丝腺功能基因表达的时空特异性中的作用。对家蚕丝腺主要（高表达量）蛋白质进行严格鉴定。在充分详细的基因功能研究的基础上，将以丝心蛋白及其基因为核心，以其复制、转录表达、包装和分泌为主线，重建这一系统的信号转导途径。利用生物信息学、分子生物学、蛋白质组学以及结构基因组学的手段和方法，推测并鉴定参与丝心蛋白基因复制的调控蛋白、启动丝心蛋白基因表达的转录因子以及负责丝蛋白包装和分泌的蛋白质因子。构建其他家蚕丝腺蛋白质合成生化途径和相关功能基因作用位点图谱，结合基因干涉和传统分子生物学技术，研究主要功能基因群的表达时空特征、调控机理和相互作用方式；结合遗传资源和突变基因，探讨这些基因在丝腺蛋白质高效合成中的作用；阐明这些基因在茧丝品质形成中的作用；克隆重要的具有应用价值的功能基因。 总的预期目标：综合利用基因组和功能基因组研究的最新手段，通过对家蚕重要经济性状相关的功能基因的研究，在理论上基本阐明家蚕绢丝蛋白质合成、发育变态、性别分化、免疫与微生物抵抗性等重要性状的遗传机理；探讨对这些主要经济性状进行遗传和分子改良的理论基础。 具体目标和技术指标： ①分离克隆200个控制家蚕绢丝蛋白质合成、家蚕发育变态、家蚕免疫和微生物抵抗性等重要经济性状的候选功能基因。其中重点包括在丝腺重特异表达的合成酶系和调节关键基因；包括性别决定网络Fem以下，Dsx以上的如Sxl、tra、intersex (ix)、fruitless、rbp等；包括在与发育相关的激素合成代谢途径中起关键作用的酶以及激素受体（E93和E96基因；包括家蚕先天免疫和对微生物抵抗相关的基因如天蚕素基因等。对其中15个关键基因（家蚕性别调控网络中能够用于性别调节的靶基因，具有广谱抗菌的抗菌肽基因，发育调控网络中激素顶层调节基因以及丝蛋白质合成的关键调节因子等）进行重点研究，弄清其结构和表达特征、生理生化功能、调控因子和调控方式，以及基因间的相互作用关系和生物学意义；探索其中10个功能基因转基因操作或者改造方法。 ②初步阐明四个机理，即初步阐明家蚕绢丝腺中丝蛋白质高效合成的分子机理，阐明家蚕蛹变态的分子机理，阐明家蚕主要免疫分子基础和对微生物抵抗性的分子机理；阐明家蚕性别决定的遗传机制。 ③在国内外核心刊物发表高质量研究论文89-95篇，其中有重要影响的论文17-19篇。 ④功能基因鉴定及基因专利申请：克隆180个重要的功能基因，对控制家蚕主要经济性状的6-8个关键基因进行重点研究，弄清其结构、功能和诱导表达特征及遗传调控方式。并申请有自主知识产权的关键调控基因和抗性基因专利6-8个。 ⑤ 培养中青年学术骨干5-7人；培养博士研究生30人、硕士研究生60人。 建议承担单位： 西南农业大学 华南农业大学 建议课题负责人： 夏庆友 西南农业大学 曹 阳 华南农业大学 学 术 骨 干： 周丛照 中国科技大学 赵 萍 西南农业大学 程道军 西南农业大学 温硕洋 华南农业大学 潘国庆 西南农业大学 经 费 比 例： 35% 课题3、家蚕重要功能基因的蛋白质产物分析 研究目的：利用蛋白质组学手段，获取家蚕主要蛋白质的动态和整体的信息，探讨蛋白质与重要经济性状的关系。 主要研究内容： （1）家蚕重要组织器官蛋白质图谱构建 利用高精度蛋白质双向电泳技术，对20个以上的家蚕各主要发育时期（卵、幼虫、蛹、成虫）的主要组织器官（家蚕血液、脂肪体、精巢、卵巢、消化器官中肠、丝蛋白质合成器官丝腺、皮肤、神经和分泌器官以及标准细胞株）中主要蛋白质进行分析，建立标准蛋白质图谱库。为提高蛋白质图谱的分辨率，其中2-D电泳将采用等电点和分子量分段建库，并利用图象分析系统和软件建立家蚕蛋白质的图谱信息库（包括分子量和等电点的精确数据）。 （2）家蚕主要蛋白质的质谱鉴定 利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF），建立蛋白质质量指纹图谱，测定这些多肽链的部分氨基酸序列；利用生物信息学检索方法，对家蚕主要蛋白质进行鉴定，即利用蛋白质质量指纹图谱，并结合源后裂解（PSD）测定的部分氨基酸残基序列，对照国际标准蛋白质库和家蚕全基因组信息由来的家蚕专一蛋白质理论指纹库，检索并鉴定3000个以上的家蚕蛋白质图谱库中可检测的蛋白质斑点，建立基因和蛋白质产物对应关系数据库。以此为基础，鉴定课题2所克隆的重要功能基因的蛋白质产物，从而在蛋白质水平研究这些基因的作用，研究其与主要经济性状的关系。 蛋白质的翻译后修饰与加工对功能的调节极其重要。本课题还将利用蛋白质组学技术，研究重点蛋白质（包括所获得与经济性状相关的功能蛋白，时期、组织特异蛋白质）的修饰与加工（主要研究糖链附加和磷酸化修饰等），探讨翻译后修饰与加工对基因功能和性状的影响。 （3）重要功能基因的比较蛋白质组学研究 以上述（1）、（2）项研究为基础，研究家蚕蛋白质在时间和空间上的分布规律，重点探讨发育时期变动和组织特异性新的蛋白质，如性别特异蛋白质、丝腺特异蛋白质和蛹特异蛋白质等，重要性状相关功能基因的研究。接种主要家蚕病原微生物（DNV病毒、NPV病毒、微粒子、白僵菌和细菌），对比研究感病和非感病的蛋白质表达差异，发现与微生物抵抗性相关的蛋白质。 由于普通蛋白质电泳只能检测高表达的蛋白质，功能上极其重要但表达丰度低的调节蛋白质因难以用常规电泳方法进行研究。因此课题还将采用ICAT（Isotope Coded Affinity Tages, 同位素标记亲和标签）技术、DIGE（Fluorescenc two-dimensional difference gel electrophoresis, 2-DIGE, 荧光胶内差异双向电泳）技术开展蛋白质比较研究，以提高表达丰度较低、功能比较重要的调节蛋白质的检测灵敏度，发现与性状相关的调节蛋白质。 预期目标： （1）建立以蛋白质组学研究技术为主体的家蚕基因功能研究确认技术体系。 （2）建立家蚕卵、幼虫、蛹、成虫4个主要发育时期的血液、脂肪体、精巢、卵巢、消化器官、丝腺、皮肤、神经和分泌器官等主要组织器官的20个以上高丰度蛋白质组标准图谱，并登录SWISS-2D-PAGE数据库。 （3）质谱鉴定3000个以上的蛋白斑点序列，数据登录SWISS－PROT数据库。 （4）建立家蚕蛋白质组学数据库。获得关键基因在家蚕机体细胞中蛋白质产物的时空分布特征，以及翻译后修饰加工的初步信息，获得20个其他家蚕组织和时期特异性表达的蛋白质。 （5）出版专著1部。在国内外核心刊物发表论文46～53篇，其中有重要影响的论文6～9篇。培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生30名、博士研究生14名。 建议承担单位： 浙江大学 重庆师范大学 建议课题负责人： 钟伯雄 浙江大学 周泽扬 重庆师范大学 学 术 骨 干： 鲁兴萌 浙江大学 缪云根 浙江大学 赵元莙 重庆师范大学 吴小锋 浙江大学 徐豫松 浙江大学 经 费 比 例： 14% 课题4、家蚕品质分子改良与素材创新研究 研究目的：建立拥有自主知识产权的家蚕转基因技术，探讨主要经济性状的分子改良方法，创造新型家蚕遗传素材。 家蚕外源基因重组到基因组的策略主要有同源重组和转座子两种，前者主要用于家蚕目的基因的改造和产生融合蛋白质，后者主要用于性状获得、基因过度表达甚至基因表达的关闭等。特别是近年研究发现，在粉刺蛾中发现的piggyBAC转座子载体，能高效地实现外源基因重组到家蚕基因组，获得能稳定遗传的转基因家蚕。但是，目前利用piggyBAC的转基因技术受国际专利保护，只对非赢利的科学研究开放使用。通过家蚕基因组计划的实施，我们发现大量家蚕自身转座元件，包括家蚕类piggyBAC因子等，基本满足家蚕转基因技术体系构建的需要。初步的研究也表明，利用家蚕自身转座元件，构建拥有独立知识产权的技术是完全可行的。 主要研究内容： （1）家蚕高转基因平台和转基因安全研究 开展家蚕转基因技术平台的研究，一方面通过功能基因的导入，研究转基因蚕的生化反应和代谢生理的变化，为家蚕基因功能的研究与鉴定奠定基础，另一方面，十实现家蚕发育变态和性别决定调节，对家蚕品质进行分子改良和素材创新必不可少的条件。本部分的研究将利用微量注射和家蚕类piggyBAC转座子载体系统，建立高效稳定的家蚕转基因技术系统；研究功能性基因导入对家蚕生理和生化的影响；开发适用于性状定向改良的转基因技术。 当前，转基因安全是必须与转基因研究同步考虑的重大问题，特别是已经发现了鳞翅目昆虫具有piggyBAC类似的转座位点和机制，因此可能存在安全隐患。课题将搜索家蚕全基因组，寻找家蚕基因组中的piggyBAC类似序列，研究其自身转座酶的活性；通过比较主要鳞翅目昆虫的同源体，分析转基因家蚕相对于其他家蚕品种和其他昆虫的安全性。 （2）家蚕外源基因的时空调控表达系统研究 利用转基因及转基因干涉技术体系，研究家蚕功能基因的改造、特定基因的过剩表达和基因敲除等；利用GAL4/UAS系统和组织器官特异性表达基因启动元件（如丝腺重链启动子等），研究在家蚕中定点、定时表达外源基因，以限定在杂交一代实现家蚕性别转换和变态调节等。 （3）基于遗传工程的新型家蚕遗传素材创新研究 建立家蚕重要性状和突变基因的近等基因系和近交系，筛选与家蚕实用性状相关的分子标记，为分子标记辅助育种奠定基础；针对目前蚕丝产业中的主要