物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究。特异引物PCR标记包括SSR标记、STS标记等，其中SSR标记已广泛地应用于遗传图谱构建、基因定位等领域。特异引物PCR所扩增的DNA区段是事先已知的明确的，具有特异性。因此特异引物PCR标记技术依赖于对各个物种基因组信息的了解。
第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。这类DNA标记可分为二种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记。另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS标记。
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。
以上四大类DNA标记，都是基于基因组DNA水平上的多态性和相应的检测技术发展而来的，这些标记技术都各有特点。表1.5和图1.1分别描述了一些主要的DNA标记的特点和遗传多态性的分子基础。任何DNA变异能否成为遗传标记都有赖于DNA多态性检测技术的发展，DNA的变异是客观的，而技术的进步则是人为的。随着现代分子生物学技术的迅速发展，随时可能诞生新的标记技术。DNA标记的拓展和广泛应用，最终必然会促进作物遗传与育种研究的深入发展。
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图1.1
DNA标记多态性分子基础示意图（引自Paterson 1996，并作修改）
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表1.5
基因组分布 遗传特点 多态性 检测基因座位数 探针/引物类型
主要类型的DNA分子标记的技术特点比较
RFLP
低拷贝编码序列 共显性 中等 1-3
gDNA或cDNA 特异性低拷贝探针
VNTR 整个基因组 共显性 较高 10-100 DNA短片段
RAPD 整个基因组 多数显性 较高 1-10 9-10bp 随机引物
高 5-10μg 中等 通常用 高 多 高
低 10-25ng 低 不用 低/中等 少 较低
ISSR 整个基因组 显性/共显性 较高 1-10 16-18bp 特异引物 低 25-50ng 低 不用 高 少 较低
SSR 整个基因组 共显性 高 多数为1 14-16bp 特异引物 中等 25-50ng 低 可不用 高 少 中等
AFLP 整个基因组 显性/共显性 较高 20-200 16-20bp 特异引物 高 2-5μg 中等 通常用 高 中 较高
DNA质量要求 DNA用量 技术难度 同位素使用情况 可靠性 耗时 成本
高 2-10μg 高 通常用 高 多 高
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第二章 DNA标记技术
生命的遗传信息存储于DNA序列之中，高等生物每一个细胞的全部DNA构成了该生物体的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。尽管在生命信息的传递过程中DNA能够精确地自我复制，但是许多因素也能引起DNA序列的变化，造成个体之间的遗传差异。单个碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等都能引起DNA序列的变异。
利用现代分子生物学技术揭示DNA序列的变异（遗传多态性），就可以建立DNA水平上的遗传标记。从1980年人类遗传学家J. G. K. Botstein等首次提出DNA限制性片段长度多态性作为遗传标记的思想及1985年PCR技术的诞生至今，已经发展了十多种基于DNA多态性的分子标记技术，这些DNA标记技术综合起来可分为以DNA杂交为基础的和以PCR为基础的以及PCR技术和限制性酶切技术相结合的几种类型。显然，检测DNA水平上的遗传变异最精确的方法是直接测定DNA序列，通过对测定的DNA序列进行分析比较，即可揭示生物体间在单个核苷酸水平上的遗传多态性。基于这一原理，最近发展了SNP标记，即单核苷酸多态性标记。尽管在植物分子标记研究中还未见这一技术的应用报道，但其应用前景是十分美好的。因此，本章在最后一节对这一新技术作了简要阐述。
第一节 基于DNA-DNA杂交的DNA标记
基于DNA-DNA杂交的DNA标记主要包括RFLP标记和VNTR标记。这类标记是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用同位素或非同位素标记的随机基因组克隆、cDNA克隆、微卫星或小卫星序列等作为探针进行DNA间杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。VNTR
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多态性是由重复序列数目的差异性产生的，而RFLP多态性主要是由于DNA序列中单碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等引起的。RFLP标记是发现最早、应用广泛、具有代表性的DNA标记技术。
一、RFLP标记技术
RFLP即限制性片段长度多态性。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。
限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子的酶。这些特定碱基组成的DNA序列叫做相应内切酶的识别位点或限制性位点，长度一般在4至8个碱基对之间。如PstⅠ的限制性位点是（其中箭头表示被切开的位置）：
5’ C TGCA↓G 3’ 3’ G↑ACGT C 5’
通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点。因此，限制性内切酶能将很长的DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA分子上限制性酶切位点的分布。特定的DNA／限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它能作为某一DNA（或含有该DNA的生物）的特有“指纹”，这种“指纹”在DNA分子水平上直接反映了生物的遗传多态性。
图2.1给出了产生RFLP的原理示意图。如果某一个限制性位点发生了突变，这个限制性内切酶将不再识别这个位点，不再进行酶切反应，产生片段的大小将由最邻近的限制性酶切位点决定。由于植物基因组很大，某种限制性内切酶的酶切位点很多，经酶解后会产生大量大小不一的限制性片段，这些片段经电泳分离形成的电泳谱带是连续分布的，很难辨别出某一限制性片段大小的变化，必须利用单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆作为探针，通过Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，
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