才能进行多态性分析。一些作物如玉米、水稻、番茄等已有覆盖整个基因组的克隆，很容易从有关单位或商家索取或购买到。但大多数作物还没有覆盖整个基因组的克隆，仍需要研制特异探针。由于具有大量的酶和探针组合可供选配，因此任何一种作物都具有大量的RFLP标记数量。RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力的过程。
图2.1 RFLP标记多态性的分子基础
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第二节 基于PCR技术的DNA标记
PCR技术是一种利用酶促反应对特定DNA片段进行体外扩增的技术，该技术只需非常少量（通常在纳克级范围内）的DNA样品，在短时间内以样品DNA为模板合成上亿个拷贝。经过电泳分离、染色或放射自显影，即可显示出所扩增的特定DNA区段。PCR技术以短核苷酸序列作为引物，并使用一种耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。典型的PCR技术通常进行25～50个循环，每个循环包括三个步骤。第一步为DNA变性，通常将温度升至94℃，使模板DNA变成单链；第二步为DNA复性，依据引物序列的长度及其与样品DNA中目标序列的同源性程度等因素，将温度控制在25～65℃，使引物与模板上的同源序列结合；第三步为DNA合成，所用温度应选择最适合DNA聚合酶活性的温度，通常为72℃。经过这样一个循环，目标DNA片段即被复制一次。随着循环数的增加，DNA扩增产物呈指数增加。PCR技术具有快捷、简易、灵敏等优点，已被广泛地应用于分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、系统分类学、遗传学和育种学等方面，在DNA标记技术的发展上起到了巨大的作用。根据所用引物的类型不同，基于PCR的DNA标记可分为随机引物的PCR标记和特异引物的PCR标记。
一、随机引物的PCR标记
随机引物PCR标记的特点是，其所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的DNA区段是事先未知的。应用这种标记技术可在基因组中寻找未知的多态性座位作为新的DNA标记。随机引物PCR扩增的DNA区段产生多态性的分子基础是模板DNA扩增区段上引物结合位点的碱基序列发生了突变。因此，不同来源的基因组在该区段（座位）上将表现为扩增产物有无的差异或扩
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增片段大小的差异（图2.3）。其中第一种情况较为常见，因此随机引物PCR标记通常是显性的，但有时也会表现为共显性，即扩增片段大小的差异。
目前，常用的随机引物PCR标记主要有可分为RAPD、AP-PCR、DAF、ISSR等。
（一）RAPD标记
RAPD标记所用的引物长度通常为9～10个碱基，大约只有常规的PCR引物长度的一半。使用这么短的PCR引物是为了提高揭示DNA多态性的能力。由于引物较短，所以在PCR中必须使用较低的退火（DNA复性）温度，以保证引物能与模板DNA结合。RAPD引物已经商品化，可以向有关供应商直接购买，不需要自己合成。商品化的RAPD引物基本能覆盖整个基因组，检测的多态性远远高于RFLP。
RAPD标记的优点是，对DNA需要量极少，对DNA质量
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图2.3 随机引物PCR产物多态性的分子基础. 类型1为显性标记，是最常见的多态性，类型2、3、4为共显性标记，但较少见
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要求不高，操作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组。在RAPD标记分析中，通常每次PCR反应只使用一种引物。在这种情况下，只有两端同时具有某种PCR引物结合位点的DNA区段才能被扩增出来。如果将2种引物组合使用，则还可扩增出两端分别具有其中一种引物的结合位点的DNA区段，产生新的带型，找到更多的DNA分子标记。在实验材料多态性程度较低时，可考虑用这种将不同引物组合使用的方法。RAPD标记的不足之处是，一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提供的信息量不完整。另外，由于使用了较短的引物，RAPD标记的PCR易受实验条件的影响，结果的重复性较差。不过，只要扩增到的RAPD片段不是重复序列，则可将其从凝胶上回收并克隆，转化为RFLP和SCAR标记，以进一步验证RAPD分析的结果。
（二）ISSR标记
简单序列重复间区（ISSR）DNA标记技术是由Zietkiewicz等（1994）提出的，该技术检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列，设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。一般在引物的5’或3’端接上2～4个嘌呤或嘧啶碱基，以对具有相同重复形式的许多SSR座位进行筛选，使得最终扩增出的ISSR片段不致太多。ISSR技术所用的PCR引物长度在20个核苷酸左右，因此可以采用与常规PCR相同的反应条件，稳定性比RAPD好。ISSR标记呈孟德尔式遗传，具显性或共显性特点。
在动植物基因组中存在大量的双核苷酸重复序列，因此，大多数ISSR标记所用PCR引物是基于双核苷酸重复序列的。近年来，ISSR标记技术已应用于植物遗传分析的各个方面，如品种鉴定、遗传关系及遗传多样性分析、基因定位、植物基因组作图研究等。Kojima等（1998）的研究表明，(AC)n双核苷酸重复序列非常适合小麦的染色体作图，并成功地定位了一系列ISSR标记。
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