（4）洗涤剂。 四、方法步骤
1．器皿准备 清洗三角瓶、培养皿、烧杯、量筒、量杯、移液管等，烘干或自然晾干备用。?
2．计算母液使用量
根据下面公式取用母液，加入烧杯中。
母液取用量（mL）＝
配制的培养基体积（mL）
母液的扩大倍数
配制1000ml 培养基需要加入各母液的量分别为： 大量元素母液：100ml 微量元素母液：10ml 铁盐母液：10ml 有机物母液：10ml
3．配制 用量筒量取870 mL[870 mL=1000 mL-100 mL（大量元素母液）-10 mL（微量元素母液）-10 mL（铁盐母液）-10 mL（有机物母液）] 的蒸馏水加入烧杯，称取琼脂7g、蔗糖20g，加入烧杯，在电炉上加热、煮沸，使琼脂溶化。等琼脂完全溶化后，加入上述各种母液。
4．激素母液添加 按照下式计算不同激素母液的需要量，加入到培养基中。
培养基配制量（L）*激素使用浓度（mg/L）
激素母液用量（mL）﹦——
激素母液浓度（mg/ml）
6-BA（1mg/ml）需要2mL、NAA母液(0.1mg/ml) 需要1mL。
5．pH调节 待温度降至50℃～60℃时，用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液调pH
值到5.8，注意用玻璃棒不断搅动，用pH试纸或酸度计测试pH。调节中，若加1滴1mol/LHCl或NaOH溶液，pH改变量超过需要值的现象，应改用低浓度HCl或NaOH溶液（如0.1mol/L调节pH）。
6．分装 搅匀培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中(温度低于40℃以下琼脂就会凝固)，每瓶25mL左右，1000mL培养基可以分装至40～50瓶，迅速扎好瓶口，写上标记。?
配制好的培养基需要进行高压灭菌后，方可使用。 五、结果与分析
1．仔细记录培养基制备中，各种母液、试剂称量的量。
2．观察在配制培养基过程中的现象与遇到的问题，并加以解释。
MS培养基母液配制（单位：毫克 mg）
母液 编种 成 分 规定量 浓缩 倍数 称取量 母液 体积 配制1升培养基吸取量定容 号 类 I 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O II 微量元素 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 6.2 0.83 10 10 10 10 10 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50 50 50 50 50 19000 16500 3700 1700 4400 2230 860 620 83 25 2.5 2.5 3730 2780 100 25 5 25 5000 500 1000 100 1000 100 10 Na2MoO4·7H2O 0.25 CuSO4.5H2O4 CoCL2.6H2O 0.025 0.025 37.3 27.8 2.0 0.5 0.1 0.5 100 铁盐 Na2-EDTA FeSO4.4H2O 甘氨酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫铵素 烟酸 肌酸 10 10 III 有机物
实验六 培养基和培养用具的灭菌
一、目的要求
通过对培养基和培养用具的灭菌，掌握高压蒸汽灭菌、干热灭菌和过滤灭菌的一般操作技术。
二、基本原理
灭菌是指用物理或化学的方法，杀死或者除去物品上所有生活的微生物，是植物组织培养中一项关键操作技术。培养基和培养用具常用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌、干热灭菌和过滤灭菌。高压蒸汽灭菌主要用于布类、衣物、玻璃器皿、胶塞胶头、过滤器、滤膜、纸类和某些培养用液等。干热灭菌主要用于玻璃器皿(如体积较大的烧杯、培养瓶等)、金属器械以及不能与蒸汽接触的物品(如粉剂、油剂等)。过滤除菌是利用一定孔径的微孔薄膜来阻隔大于孔径的细菌等微生物颗粒，从而达到除菌目的。热不稳定、在高温蒸汽灭菌中可能会降解的物质和含这些物质的液体培养基常用过滤的方法除去微生物。
三、材料与用具
培养皿、三角瓶、试管、烧杯、滴管，胶头、微孔滤膜滤器、注射器、吸水纸、装有培养基的培养瓶、装有蒸馏水的玻璃瓶、牛皮纸、纱布或铝箔，镊子、剪刀等金属器械、搪瓷盘、高压灭菌器、烘箱等。
四、方法步骤 1．高压蒸汽灭菌
（1）包扎。用牛皮纸或铝箔把经洗涤干燥的玻璃器皿以及其他用具包扎好。小器皿可以放在搪瓷盘中一起包扎。用500mL广口瓶装取300～400mL蒸馏水，封口、灭菌后制备无菌水。每小组取干净的9cm培养皿3套，每套培养皿中放入3～5张定性滤纸，盖好盖子，用报纸包裹。
（2）注水。给高压灭菌器内注入一定量的水，达到要求的水位。
（3）装锅。把装有培养基的培养瓶、装有蒸馏水的玻璃瓶和包扎好的玻璃器皿、以及其他用具，放入高压灭菌器。装的不能太紧实，并且不能堵住通气孔。
（4）灭菌。接通电源，设臵灭菌时间和温度，一般压力达108kPa，锅内的温度为121℃时，保持15～20min即可达到灭菌效果。灭菌结束后切断电源，让灭菌器自然冷却。
（5）储存。冷却后，把培养基从灭菌器中取出，放臵在温度低于30℃(最好是4℃～10℃)，没有强光照射的专用柜中备用。其它器皿（不包括无菌水）应立即放到60℃～70℃烤箱内烘干，再贮存备用。
2．干热灭菌
（1）放臵。把洗涤干净的玻璃器皿、搪瓷盘以及金属器件用羊皮纸包裹后臵于烘箱中，物品间要留有空隙，物品不要靠近加热装臵，避免局部温度太高烤焦包装纸和布等。
（2）灭菌。接通烘箱电源，打开鼓风机，设臵灭菌温度。一般在160℃温度下，干热
灭菌2h；或180℃下 1h。有时还应根据对象延长灭菌时间。
（3）冷却。灭菌结束后，切断电源，使物品室逐渐冷却后再打开，忌立刻打开，以免温度骤变而使箱内玻璃器皿破裂。用此法灭菌的物品干燥，易于贮存。
3．过滤灭菌
（1）浸膜。将0.45μm、0.22μm这两种过滤膜分别用蒸馏水浸泡，使其充分湿润。 （2）装膜。将湿润好的滤膜小心装入经洗涤干燥的微滤器中拧紧。用记号笔标明滤器中中膜的规格。
（3）高压蒸汽灭菌。将装滤膜的滤器包装灭菌，具体操作参照“1”。（若用进口一次性滤器，前三步可省）
（4）过滤灭菌。将配制好的需要灭菌的液体盛在小烧杯中，用注射器吸取若干，装上灭过菌的装有滤膜的滤器，轻推注射器将液体过滤在无菌的容器中。一般先用0.45μm的滤膜过滤一次，再用0.22μm的滤膜过滤。过滤后的液体臵于无菌容器中，并用封口膜封口。过滤过程在超净工作台上进行。
（5）贮存。将过滤灭菌后的液体放在4℃冰箱内保存备用。 五、结果与分析
1．植物组织培养中哪些试剂需要过滤灭菌？
2．高压灭菌时应注意哪些事项?
3．培养基高压灭菌后，如未能凝固，可能有哪些原因？
实验七 外植体的选择与初代培养
一、目的要求
学习各种不同外植体初代培养的基本过程，初步掌握材料的清洗、灭菌、切割、接种等操作技术；掌握超净工作台的使用方法。 二、基本原理
植物离体培养能否成功主要与外植体的制备、无菌操作和人工培养环境有关，无菌外植体的制备是第一步。从母体植株上取下一定的组织或器官，先进行剥离和分割，并经流水冲洗，去除表面的灰尘和大部分细菌和真菌，再浸入适宜浓度的化学药剂中进行表面消毒，最后经无菌水冲洗并适当切割后接种在培养基上。制备外植体的原则是无菌和有活性。无菌是最基本的要求，有活性是外植体制备的前提，无活性的外植体是毫无意义的。
三、材料、试剂与主要仪器
1．仪器、用具 超净工作台、乙醇灯、镊子、解剖刀、解剖针、烧杯(50mL)、标签纸、剪刀、乙醇棉球、广口试剂瓶、纱布（擦拭台面）、无菌培养皿、无菌滤纸等。
2．试剂 75%乙醇、95%乙醇、2%NaClO溶液（指有效氯含量2%）、无菌水等。 3．植物材料 长寿花、非洲紫罗兰等植物的嫩茎。