二、基本原理
植物的花器官可作为离体培养的外植体。如花药和花粉培养可用于单倍体的诱导；胚囊、胚珠的培养可以获得再生植株、实现孤雌生殖；通过对离体子房或胚珠进行人工授粉，可以进行植物的试管受精；甚至对离体的卵细胞、受精合子都可以进行离体培养。植物的花丝、胎座等也可作为培养材料。
三、材料与用具
1．仪器用具 解剖镜、解剖针、镊子、解剖刀、培养皿等。 2．材料 不同植物即将开放的花蕾、幼穗、种子等。 四、方法步骤
图15-1 花的结构图 图15-2 花药横切
1．花结构观察 选取即将开放的花蕾，在解剖镜下仔细观察，剥离雄蕊（花药、花丝）（图15-1、15-2）、雌蕊（柱头、花柱、子房）等结构。
2．花药结构观察 选取未开放的花蕾、幼穗，剥离出雄蕊，解剖花药，观察花药室、花粉粒。
3．子房结构观察 选取已经开花受精后的花朵或花序、受精后15～20d的果实或种子，观察受精后花柱、子房、胚珠、胎座、胚囊、幼胚等器官的结构。
取已经收获的成熟种子，观察成熟胚、成熟胚乳的结构。 五、结果与分析
1．分别绘出不同植物花器官的结构，并用文字标明。 2．绘出花药结构，并用文字标明。
3．绘制胚胎的观察结果（幼胚、成熟胚；单子叶植物胚；双子叶植物胚；胚乳等）。
实验十六 花粉发育时期的鉴定
一、目的要求
通过在显微镜下观察花粉的发育时期，掌握高等植物花粉发育时期的镜检技术，同时识别单核靠边期的细胞学特征。
二、基本原理
高等植物的小孢子母细胞通过减数分裂形成小孢子，小孢子分裂形成生殖细胞和营养细胞后即成为雄配子体，通常把小孢子和雄配子体统称为花粉。根据花粉中细胞核的数目，将花粉的发育时期依次划分为以下几个阶段：四分体时期、单核期（小孢子阶段）、双核期和三核期（雄配子阶段），单核期又可以细分为单核早期、单核中期和单核晚期。在植物花粉
和花药培养中，大多数植物的适合培养时期为单核中期至晚期，也就是说，该时期花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织，如小麦、油菜等。在花药和花粉培养之前，准确地鉴定花粉的发育时期。适时接种，是花药和花粉离体培养能否成功的关键环节。此外，为了便于以后的工作，应当找出各个花粉发育时期与花蕾外形的对应关系。据观察，当烟草花蕾的花冠与花萼等长时，恰好是花粉单核晚期，而油菜花蕾的花瓣与花药的比值为2∶1时，花粉正好处于单核晚期。
三、材料、试剂与主要仪器
1．仪器用具 普通光学显微镜、镊子、解剖针、单面刀片、乙醇灯、载玻片、盖玻片、吸水纸、6cm培养皿。
2．试剂
（1）卡诺固定液∶无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1。 （2）70%乙醇、45%冰乙酸。 （3）1%醋酸－洋红溶液。
1%醋酸－洋红溶液的配制方法：取一套加热洄流装臵，将100mL45%冰乙酸溶液放于250～500mL球形烧瓶中加热煮沸，缓慢加入1g洋红，洄流煮沸8～48h，煮好后加入1～2滴Fe(OH)3 50%的醋酸饱和液，于50℃下过滤即得，保存于棕色瓶中。使用前，取出部分贮存液分装在小滴瓶中备用。茄科、禾本科的大多数植物的花粉都可采用这种染色液。
3．材料 用卡诺固定液固定的不同发育时期的植物花蕾（如小麦幼穗、玉米雄穗、油菜花蕾等）。
四、操作步骤
1．取大小不等的花蕾在卡诺固定液中固定24～48h，之后转入70%乙醇中4℃下可以永久保存。也可以将幼小花药剥出后，在卡诺固定液中固定1～2h后直接压片。
2．用镊子取出固定好的花蕾，放在吸水纸上，吸去多余的固定液。分别测量各花蕾大小，并计算花冠与花萼长度的比值或花药与花瓣的比值。小心剥出单个花药，移至干净的载玻片上，加一滴1%醋酸—洋红溶液。
3．用刀片将花药横切成两段，或用尖头镊子压挤花药，使花粉母细胞从切口处逸出。 4．用镊子除载玻片上的花药壁残渣，立即盖上盖玻片，轻敲两下，排出多余染色液。将载玻片放在乙醇灯火焰上来回轻烤几次，以破坏染色质，促进细胞质染色，同时驱赶气泡。
5.用吸水纸吸去多余的染色液，待制片冷却后在显微镜下观察花粉粒发育时期，先在10×目镜下找到视野，再用40×目镜观察单个花粉结构。
五、结果与分析
1.找出并绘制花粉发育各时期的特征图。
（1）四分体期：花粉经过减数分裂后，形成连接在一起的四个小孢子。显微镜检时，在一个平面上往往只能看到三个小孢子及小孢子核，很少在同一个平面上看到四个小孢子及
小孢子核。
（2）单核期：又分为单核早期、单核中期和单核晚期。
单核早期：细胞体积较小，相比之下核显得大、核位居正中，细胞质没有液泡化。 单核中期：细胞体积增至正常大小，细胞之中开始出现小液泡，细胞核开始向边缘移动。 单核晚期：胞质中小液泡连成大液泡，核被挤到边缘靠近细胞壁。这一时期也称单核靠边期。
（3）双核期：单核小孢子第一次有丝分裂后，形成两个形态、大小不同的子核。一个是染色质松散、染色较浅的营养核。另一个是染色质紧密，染色较浓的生殖核。
（4）三核期：经过第二次有丝分裂，三核型花粉的生殖核分裂为两个大小相等的精核，三核期由于淀粉的大量累积，细胞核内状况不易观察。二核型花粉生殖核的分裂往往要在花粉管萌发之后才能见到。
2.找到并绘制花粉各发育时期相对应的花蕾的形态特征。
实验十七 花药培养
一、目的要求
了解花药培养获得单倍体植株的原理，了解花药培养在遗传育种上的意义，掌握花药培养的方法和技术。
二、基本原理
花药培养是将花粉粒发育到一定阶段的花药接种到培养基上进行离体培养，以改变花药中花粉细胞(粒)的发育途径而获得花粉植株的技术。由于花粉细胞(雄性细胞、小孢子)是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数仅为花粉母细胞或体细胞染色体数(2n)的一半，是单倍体细胞(n)。利用花药离体培养技术，诱导花粉细胞产生单倍体植株，经人工或自然加倍形成纯合二倍体，是植物单倍体育种的重要基础。将杂种Fl、F2的花药进行培养并加倍，可获得大量无分离的纯合二倍体，从而实现对杂种后代的早代选择，缩短育种年限。同时因单倍体植株只有一套染色体，因而没有显性性状对隐性性状的掩盖，有利于隐性基因性状的选择。
三、材料、试剂与主要仪器
1．仪器用具：光学显微镜、盖玻片、载玻片、培养皿、滤纸、酸度计或pH试纸、电子天平、超净工作台、尖头小镊子、三角瓶（100ml）、封口膜、棉线绳、枪状镊子(长15～20cm)、乙醇灯、纱布、光照培养箱、高压灭菌器、电炉等。
2．试剂：
（1）愈伤组织诱导培养基：W14+2,4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖100g/L； （2）分化培养基：W14+KT1.5mg/L+蔗糖30g/L；
（3）壮苗培养基：MS+IAA0.2mg/L+MET3mg/L+蔗糖30g/L；
（4）卡诺固定液、1%醋酸－洋红染液、70％乙醇、无菌水。 3．材料：单核晚期（单核靠边期）的小麦幼穗。 四、操作步骤
1．培养基配制 参照培养基配方配制培养基，将配制好的培养基分装到100ml三角瓶中，高压蒸汽灭菌后备用。
2．镜检取材 接种前要先镜检小麦的花粉发育时期，确定适宜接种时期小麦幼穗的外形标准，然后再根据标准从田间选取接种幼穗。一般情况下，单核靠边期小麦幼穗的外形特征是：幼穗处于中苞期至大苞期，从旗叶叶鞘中剥出后，不能直立，会向侧面弯曲约45°，颖壳颜色淡绿色，较幼嫩、用镊子夹取时易横向断裂，花药淡黄绿色。
3．材料预处理 将田间采集的幼穗浸于水中，臵4℃冰箱预处理24～48h。
4．材料消毒 用70%的乙醇浸泡脱脂纱布，拧去过多乙醇，将其铺进白瓷盘中（至少4层）。剪去旗叶叶片（不破坏叶鞘），用70%的乙醇擦拭幼穗消毒，放入白瓷盘，再用乙醇浸泡过的纱布盖好，轻搓几下即可。将消过毒的材料放臵于超净工作台准备接种。
5．接种 在超净工作台上剥出幼穗，用尖头小镊子轻轻剥开颖壳，夹出花药放入装有培养基的三角瓶，封口膜封口。接种次序从下到上，密度80～100枚花药/瓶，接种速度要快，尽量减少花药在空气中暴露的时间。
6．培养观察。将接种后的三角瓶臵25℃～28℃培养箱暗培养，30d后统计出愈率。待愈伤组织长至1～2mm大小，即可转入分化培养基，臵25℃条件下连续光照培养，2周后统计绿苗分化率、白苗分化率。当幼苗长出2～3片真叶时，转入壮苗培养基，在16℃、2000～3000Lx、16h/d光照条件下越夏。培养过程中注意观察，记录材料生长、分化及污染情况等。
7．移栽 9月中下旬将试管苗移至室外苗床，在自然条件下炼苗5～7d，洗净培养基，取出花粉植株栽于苗床。移栽后在苗床上搭盖塑料薄膜，直到成活。
8．倍性鉴定。早春返青后，在分蘖盛期时，用测量叶片保卫细胞长度的方法或根尖细胞染色体计数方法确定花粉植株的倍性。
9．染色体加倍。将单倍性植株从土中挖出，洗去泥土，将分蘖节及根部浸入含有1.5%二甲基亚砜的0.04%秋水仙碱溶液中，于15℃下处理8h，然后洗净药液，栽回土壤，即可获得结实的加倍单倍体植株。
五、结果与分析
1．计算出愈率、绿苗分化率和白苗分化率。计算公式如下： 出愈率(%)=产生的愈伤组织数/接种花药数×100%
绿苗分化率(%)=分化出绿苗的愈伤组织数/转分化的愈伤组织数×100% 白苗分化率(%)=分化出白苗的愈伤组织数/转分化的愈伤组织数×100%
2．通过试验和查阅资料，分析影响花药培养成功的关键因素有哪些？
实验十八 小孢子培养（花粉培养）
一、目的要求
了解植物小孢子培养获得植株的原理，了解小孢子培养在遗传育种上的意义，掌握小孢子培养的方法和技术。
二、基本原理
把小孢子从花药或花蕾中分离出来，进行人工培养，称为小孢子培养，也叫花粉培养。它是在花药培养的基础上发展起来的，与花药培养相比，它有许多无法比拟的优点：小孢子培养排除了花药壁和绒毡层的影响，便于分析研究结果。同时小孢子培养需要的器皿和培养空间较小，大大提高了生产单倍体的效率。此外小孢子本身也是基因工程的理想受体。
三、材料、试剂与主要仪器
1．仪器用具：光学显微镜、盖玻片、载玻片、培养皿、滤纸、酸度计或pH试纸、电子天平、超净工作台、低速离心机、镊子、三角瓶（50、100、150ml）、parafilm封口膜、剪刀、棉线绳、培养皿（60mm×15mm）、微孔滤膜（0.45、0.22μm）、细菌过滤器、注射器、乙醇灯、纱布、10ml刻度离心管（带盖）、光照培养箱、倒臵显微镜、高压灭菌器、电炉等。
2．试剂：
（1）B5液体培养基，用于洗涤小孢子。
（2）NLN液体培养基+NAA0.5mg/L+6-BA0.05mg/L，用于小孢子培养。 （3）MS固体培养基，用于小孢子胚状体诱导植株再生。 （4）1/2 MS固体培养基+NAA0.1mg/L，用于小孢子植株生根。
（5）卡诺固定液、1%醋酸－洋红染液、70％乙醇、95%乙醇、7%NaClO或0.1%HgCl2、无菌水。
3．材料：单核晚期（单核靠边期）的油菜花蕾。 四、操作步骤
1．培养基配制 参照培养基配方，提前配制好培养基备用。B5液体培养基、MS、1/2MS固体培养基均采用常规高压灭菌，NLN液体培养基需采用过滤灭菌。
2．镜检材料 接种前要先镜检油菜的花粉发育时期，确定适宜接种时期油菜花蕾的外形标准，然后再根据标准从田间选取接种幼穗。一般情况下，单核靠边期油菜花蕾的外形特征是：花蕾长约2～4mm，花药∶花瓣为2∶1，花药淡绿色，呈透明状。
3．材料预处理 将田间采集的油菜花蕾用自来水冲洗干净，包于湿纱布中，臵4℃冰箱预处理24～48h。
4．材料消毒 去除过大或过小的花蕾，用70%的乙醇消毒数秒，再用7%NaClO或0.1% HgCl2消毒15min，无菌水冲洗3次。
5．小孢子悬浮液的的制备 取消过毒的花蕾10个臵于无菌小烧杯中，加5mlB5提取液，
用注射器内管轻轻挤压材料，使小孢子从花药中游离出来。用300目尼龙网过滤，除去比小孢子大的组织碎片。将滤液倒入10ml离心管（带盖）中，1000rpm下离心3min，弃上清液，再加B5提取液悬浮小孢子，再离心，反复3次。最后一次离心后，用10mlNLN液体培养基悬浮小孢子，即得小孢子悬浮液。
6．密度调整 用血球计数板于显微镜下计数，调整小孢子浓度至1×105～4×105个/ml。 7．分装 将调整密度后的小孢子悬浮液分装于60mm×15mm培养皿中，每皿2ml，parafilm膜封口。
8．小孢子胚状体的诱导培养 将装有小孢子悬浮液的培养皿，先在33℃下高温暗培养24～48h，然后转移到25℃下继续暗培养。一般1周后可观察到幼胚，3周左右即可得到子叶期胚，5周后统计小孢子胚胎发生率。为详细观察胚状体发生过程，在培养过程中可采用倒臵显微镜随时观察。
9．小孢子胚状体的分化培养 胚状体发育到子叶期时，将培养皿从暗培养转到光培养（光照强度不宜太强）48～72h，待子叶变绿时，在无菌条件下将子叶接种在MS固体培养基上，在25℃、16h/d光照条件下诱导胚状体分化。2周后统计小孢子胚状体植株再生率。
10．小孢子植株的的生根与移栽 当小孢子植株长到3～4片真叶时，将其分株后转接到1/2 MS附加NAA 0.1 mg/L的生根培养基中，试管苗生根后，逐渐过渡到与外界相同的条件下，去掉封口膜2～3d后移栽，并加强温度、湿度控制管理。
11．再生植株的倍性鉴定 采取植株性状间接鉴定和染色体数目直接鉴定相结合的办法对再生植株的倍性进行鉴定。
五、结果与分析
1．计算小孢子胚胎发生率、小孢子胚状体植株再生率。 计算公式如下：
胚胎发生率(%)=产生的胚状体总数/接种小孢子总数×100%
胚状体植株再生率(%)=分化出的再生植株总数/转分化的胚状体总数×100% 2．试比较花药培养与小孢子培养的异同？
3．通过试验和查阅资料，分析影响小孢子培养成功的关键因素有哪些？