生化实验思考题总汇
请学生听从老师安排准备思考题，要求每位同学必须参与。请组长分配全组同学准备，每个人将思考题做成ppt，将文件发到公用邮箱中或者放在网上，上课提前10分钟到实验室，下载到讲台计算机桌面指定文件夹中，上课时由该位同学讲解。一般情况下不允许优盘拷贝。
Biochemistry_1@126.com，密码120_122 ppt文件名格式为：实验名(汇报人姓名) 思考题目录
一、总论┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 1 二、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究1（亲和层析分离纯化）┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄2 三、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究2（考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质浓度）┄┄2 四、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究3（酶活力、米氏常数、最大反应速度）┄┄┄┄2 五、细胞色素c的制备及其含量测定┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 3 六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 3 七、免疫印迹Western blotting ┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 3 八、酶联免疫吸附测定（间接法）┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 4
一、总论——实验前需要了解的实验技术
1． 层析技术：亲和层析，吸附层析，凝胶过滤层析，离子交换层析，了解各种层析技术的原理，使用的仪器
2． 离心技术：低速离心，高速离心，离心应注意的问题 3． 可调式移液器的使用：操作及注意事项
4． 分光光度计的使用：紫外分光光度计，可见分光光度计，酶标仪 5． 酶活力，米氏常数，最大反应速度，比活力的概念及常用的测定方法 6． 测定蛋白质浓度的几种常用方法，了解其原理及其优缺点 7． 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、分类、介质、染色方法等
8. 生物大分子提取制备技术：盐析，盐溶，等电点沉淀，有机试剂沉淀，透析等，了解其原理及操作
9. 免疫印迹法（Western blotting）及酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理
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二、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究1（亲和层析分离纯化） 1. 了解谷胱甘肽转硫酶。
2. 在生物大分子提取制备前期，实验材料如何进行预处理，列举几种常用粗提蛋白质的实验方法。
3. 层析分离生物大分子的方法有哪些？简单介绍各种方法的原理（列举三种即可，亲和层析不必细讲）。
4. 亲和层析分离纯化生物大分子的原理，影响亲和层析的几种因素。
5. 关于亲和层析配基、载体的选择，载体和配基偶联的条件，应注意哪些问题。 6. 亲和层析的洗脱方式有哪几种？
7. 本实验中Buffer A和B中各组分的作用是什么？如果使用错误会出现什么后果？ 8. （1）本次亲和层析实验中应注意的问题有哪些？
（2）使用紫外检测仪需要注意什么？主要说明平衡时紫外检测仪和记录仪调整基线的重要性，层析过程中灵敏度设置的必要性（基线为检测仪没有蛋白质峰出现时的记录线，一般调整为记录纸上右边一大格的位置；在上样时调整紫外检测仪低灵敏度，收集样品时提高灵敏度）。
（3）记录仪的纸速对洗脱峰有什么影响？
三、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究2（考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质浓度）
1. 定量测定蛋白质含量的常用方法有哪些？简述其适用范围（不必细讲）。
2. 紫外吸收法、双缩脲法、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理是什么？具有什么优缺点？ 3. 简述考马斯亮蓝显色法的原理和测定方法。考马斯亮蓝G-250和R-250在结构和使用上有何区别？
4. 说明可调式移液器的使用注意事项，平行操作的必要性。
四、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究3（酶活力、米氏常数、最大反应速度）
1. 2. 3. 4.
酶促反应速度的影响因素有哪些？如何测定酶促反应速度？
简述酶活力、国际单位、比活力的定义。测定酶活力和比活力的意义是什么？ 简述谷胱甘肽转硫酶酶活力测定的原理及测定方法。
简述测定酶的米氏常数和最大反应速度的方法，说明终止法的操作方法及其优点。
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五、细胞色素c的制备及其含量测定（此部分由2个大组讲，1～4为一组题，5～8为一组题） 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1． 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理？凝胶聚合的催化体系有哪些？
2． 哪些因素影响聚丙烯酰胺凝胶的特性？在实际工作中，如何选择合适的凝胶浓度使蛋白质混合物得到最大限度的分离？净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的特点是什么？
3． 简述SDS-PAGE不连续电泳测定蛋白质相对分子质量的原理。什么是连续系统和不连续系统？有何优缺点？
4． 样品处理液中各组分的作用是什么？染色常用考马斯亮蓝R-250和G-250，两种方法有什么异同？
七、免疫印迹Western blotting
1. 免疫印迹Western blotting技术的原理，主要过程及其主要应用。
2. 免疫印迹Western blotting技术中如何选择一抗和二抗，二抗主要有哪几种类型。 3. 免疫印迹中转膜液的作用是什么？转移过程中蛋白质的迁移方向如何，为什么？
简述离心技术和膜分离技术的基本原理及应用。离心机的使用应注意哪些问题？ 介绍现代生物质谱在蛋白质组学研究中有哪些应用 测定蛋白质相对分子质量有哪些方法，其优缺点是什么？ 染色质免疫共沉淀Chip技术的原理及操作步骤
为什么要对蛋白质脱盐，有哪些方法可以对蛋白质样品进行脱盐处理。 介绍高通量测序技术及其在现代生物学研究中的应用
以细胞色素C为例解释猪心细胞色素C提取制备每步的基本原理？ 介绍研究蛋白质相互作用的研究方法，并重点介绍其中一种的过程。
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4. 免疫印迹中封闭液的作用是什么？
5. 蛋白质从凝胶转印到膜的过程中电流过高有什么影响？
6. 什么是绿色荧光蛋白GFP以及GFP发现的历史。介绍绿色荧光蛋白GFP在现代生
物学研究中主要应用。
7. 免疫印迹的显色方法有哪些？各有什么优缺点？
8. 详细讲解His-tag或者GFP-tag融合蛋白表达纯化的流程及主要应用。
八、酶联免疫吸附测定（间接法）
1. 介绍酶联免疫吸附测定法ELISA的原理，操作过程及主要应用。 2. ELISA实验中有哪些注意事项？
3. 什么是磷酸化蛋白及其功能分类，查阅文献资料介绍目前磷酸化肽富集的主要方法
及其原理（详细介绍其中1种方法）。
4. 什么是糖蛋白及其功能分类，查阅文献资料介绍目前糖蛋白富集的主要方法及原理
（详细介绍其中1种方法）。
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