1.1主要试剂 RPMI1640培养液 小牛血清
二甲基亚矾(DMSO) 四甲基偶氮盐(MTT) 阿霉素 长春新碱 紫杉醇 1.2主要仪器 层流洁净细胞培养室 医用净化工作台 CO2培养箱
酸碱度离子计测定仪 倒置显微镜 液氮生物容器 低速离心机 电子天平 自动板式酶标仪 低温冰箱 96孔细胞培养板 1.RPMll640培养基配制:
把制备培养基的器皿清洗干净,烤干后备用(滤器、滤膜、量筒、移
液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌)。秤取RPMI1640粉剂10.39g;HEpES3.5g;NaHCO30.75g,青霉素(80万U/瓶)0.05g,链霉素(100万U/瓶)0.05g,将上述成分用900ml三蒸水溶解(三蒸水实验前一天制备),搅拌均匀,测定pH值,用5%NaHCO:调节pH值维持在7.2-7.4之间,采用0.45um和0.22um滤膜各一张,上层为0.45um,下层为0.22um过滤除菌,将100间小牛血清均分到各瓶,放于-20℃冰箱中冷冻储存。\\ 2.PBS缓冲液的配制:
秤取Nacl 8.0g；Kcl 0.20g;Na2HPO4.H2O 1.56g; KH2PO4 0.20g,将上述成分用l000ml三蒸水溶解,搅拌均匀,测定PH值,维持在7.2-7.4之间,分装后放入冰箱中冷藏,待用时高压消毒。 3.MTT溶液配制方法:
实验中MTT浓度为5mg/ml。称取MTT0.5克,溶于100ml的磷酸缓冲液中,用0.22um滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器用铝箔一纸包住。 步骤
1.乳腺癌MCF-7/S（敏感细胞）与MCF-7/ADM（耐药细胞）培养
人乳腺癌敏感细胞株MCF-7/S以及耐药细胞株MCF07/ADM均购自中国医科院天津血研究所。MCF-7/S细胞常规培养于含10%小牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMII1640培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内长期传代培养。相应MCF-7/ADM连续培养在含1.0mg/L阿霉素（ADM）的上述培养液中，培养条件相同，
保持其耐药性。MCF-7/ADM细胞在实验前两周无药培养，取对数生长的两种细胞进行实验。
2．MTT法确定无或低细胞毒作用的半边旗二萜类成分浓度 MTT法检测半边旗的细胞毒性
(l)半边旗对MCF一7/ADM细胞毒性的测定:
在实验前2周将耐药细胞株MCF一7/ADM置于不含ADM的培养液中培养,实验均取对数生长期细胞,制备细胞悬液,调整细胞浓度为lx104个/ml,接种在96孔板内,实验组和对照组每孔加人200ul细胞悬液,预培养24h后,弃去上清液,实验组更换为含不同浓度半边旗的培养液180ul /孔,使半边旗浓度分别为0.005、0.05、0.5、5、50mg/ml。对照组加等体积的培养液。每组设6个复孔。实验分如下三组进行 A.实验组:不同体积的半边旗 (使终浓度分别为0.005、0.05、0.5、5、50m g/ml)+McF-7/ADM
对照组:1.加入跟半边旗相同体积的RPMI1640培养液+McF-7/ADM。
2.加入跟半边旗相同体积的VPL培养液+MCF-7/ADM 空白组:只加培养液不加肿瘤细胞。
药物作用48小时后,向各组加入MTT贮存液20ul/孔,在37℃、5%co2条件下培养4小时,然后终止培养,慢慢吸去孔内培养液,每孔加入150ul二甲基亚矾(DMSO),置振荡器上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。取6孔平均值计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(OD实验组-OD空白组/OD对照
组-OD空白组)X100％
依(半边旗)药物浓度-抑制率绘制剂量效应曲线,按公式计算细胞抑制率:
抑制率(lR)=(1-药物处理组A490/药物未处理组A490)x100%,
通过由IR对药物浓度作图,求出细胞生长抑制50%的药物浓度(IC50)值及10%抑制浓度(IC10)。实验重复3次,取其平均值。 (2)半边旗对McF-7/S细胞毒性的测定: 操作同前,分组如下:
A.实验组:不同体积的半边旗 (使终浓度分别为0.005、0.05、0.5、5、50mg/ml)+McF-7/ADM
B.对照组:1.加入跟半边旗相同体积的RPMI1640培养液+McF-7/ADM。
2.加入跟半边旗相同体积的VPL培养液+MCF-7/ADM C.空白组:只加培养液不加肿瘤细胞。
药物作用48小时后,利用MTT法测oxy对McF-7/S细胞抑制率。确定抑制率≤10%的药物浓度为该药的非细胞毒性剂量。 3.MTT法检测细胞多药耐药性
实验前2周将MCF-7/ADM细胞置于不含ADM培养液中培养。取对数生长期细胞McF-7/ADM与MCF- 7/s以2.5X104 /ml分别接种于96孔培养板,培养过夜后分别加不同浓度梯度的化疗药ADM、长春新碱(VCR)、紫杉醇,实验分组如下:
(1) 细胞分组:MCF-7/ADM与MCF-7/S两组(细胞浓度相同)。 (2) 实验分组:
实验组为三个药物浓度组(180ul细胞悬液+20ul不同浓度药物)。 对照组(180ul细胞悬液+20ul细胞培养液)。 空白对照组(200ul细胞培养液)。
药物作用24小时,行MTT法,通过由IR分别对ADM、VCR、Taxol浓度做剂量效应曲线,分别求出细胞生长抑制50%的ADM、VCR、Taxol浓度,即IC50。计算各药耐药倍数。耐药倍数=IC50耐药细胞/IC50
敏感细胞
(注:McF-7/5和McF-7/ADM细胞浓度相同)。
4.MTT法检测半边旗的多药耐药逆转作用
取对数生长期细胞MCF-7/ADM以细胞密度2.5x104/ml分别接种于96孔板内,过夜,实验分如下三组进行:
A.实验组:半边旗 (0.00 mg/ml)分别与不同浓度梯度的ADM,VCR,TAXOL,作于MCF- 7/ADM细胞。
B.对照组:不含oxy,单独不同浓度梯度的ADM、VCR,TAXOL作用于MCF-7/ADM细胞。
C.空白组:不含细胞的培养基。实验操作同前,每组设6个复孔。药物作用24小时后,利用MTT法,做抑制率曲线。计算逆转倍数,逆转倍数=耐药细胞逆转前IC50/耐药细胞逆转后IC50。