微生物大小和数量的测量
姓名：俞华军 班级：09生科三班 学号：200900140157 日期：2010/11/25
组别：四 同组者：谢英健 张刚刚 岳永胜 余振洋
一．实验目的
1．学习并掌握测微尺的使用和计算方法。
2．了解血球计数板的构造、明确其计数原理，掌握使用血球计数板显微镜
下直接进行微生物计数的方法。
二．实验原理
l．测微尺：显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成。
目镜测微尺：一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在 5mm 刻尺 上分 50 份。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。
镜台测微尺：为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为 1mm 的直 线等分成 100 个小格，每格长 10μm，专用于校正目镜测微尺。
目镜测微尺的标定：将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上，调节视野使镜台测微尺能被清晰看到后，转动目镜和推进器使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度在某一区域内完全重合，然后分别数出量重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数（如下图）：
由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据一下公式即可算出在不同放大倍数下目镜测微尺每格所代表的长度：
两重合线间镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每格长度（μm）=
两重合线间目镜测微尺格数
球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示。 2．显微直接计数法
显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌
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或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板：是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3 个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为
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0.1mm。
使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设五个中方格中的总菌数记为A，菌液稀释倍数为B，则： 1ml菌悬液中含有细胞数=﹙A/5﹚×25×104×B 三． 实验器材
1． 菌种 ： 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，枯草芽孢杆菌
2． 仪器或其他用具：显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，擦镜纸，香柏油，
二甲苯，双层瓶，血球计数板，盖玻片，载玻片，吸水纸，计数器，无 菌滴管，移液管（5ml和2ml），接种环，酒精灯，美蓝染液，玻璃棒等。
四． 实验步骤
1．微生物大小的测定 （1） 目微尺的安装：
把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。 （2） 目微尺的标定
将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。根据一下公式计算该放大倍数下目镜测微尺每格的实际长度。 两重合线间镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每格长度（μm）=
两重合线间目镜测微尺格数
同样方法换用高倍镜和油镜分别进行校正。
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（3）细菌制片的制作
A．枯草芽孢杆菌（简单染色）：取一干燥载玻片，于中央滴一滴清水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌斜面培养物取适量菌于清水上，使清水呈混浊状，干燥固定后进行细菌的简单染色，滴加美蓝染液染色1min左右后水洗，干燥即可。
B．酵母菌（水浸片）：取一干燥载玻片，用无菌滴管从酵母菌培养液中取一滴菌液滴于载玻片中央，盖上盖玻片即可。 （4）菌体大小的测定
将镜台测微尺取下，换上细菌染色制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。每种菌种至少测三个，求出平均值即可。
（5）整理
擦干净显微镜，收拾好镜台测微尺和目镜测微尺。
2．酵母菌数量的测定
（1） 检查清洗血球计数板
在加样前先检查血球计数板是否可用，随后用自来水清洗血球计 数板，然后自然干燥。 （2） 加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，再用镊子轻压盖玻片，以免因菌液过多将盖玻片顶起而改变了计数室的容积。静置5min。 （3） 显微镜计数
将加有样品的血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。观察后我们发现浓度太浓，稀释了10倍后重新加样品进行计数。每个计数室选5个中格（选择4个角和中央的一个格）进行计数。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。完成计数后，根据以下公式即可计算出菌数。 1ml菌悬液中含有细胞数=﹙A/5﹚×25×104×B （4） 清洗
使用完毕后，将血球计数板及盖玻片进行清洗、干燥后，收好。
五．实验结果记录
表一 目镜测微尺校正结果 目镜测微尺每格代表的长度/μm 9.857 低倍镜 ×10 70 69 2.653 高倍镜 ×40 49 13 0.964 油镜 ×100 83 8 目镜放大倍数：×10 物镜 物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数
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菌种 枯草芽孢杆菌 酿酒酵母 目镜测微尺每格代表长度/μm 0.964 0.964
表二 细菌大小测定结果 长（目镜测微尺平均宽（目镜测微尺平均格格数） 数） 1 3 2 3 平均 4.1 6.4 1 0.3 5 2 0.4 5.1 3 0.5 5.3 平均 0.4 5.15 菌体大小（长2 ×宽）/μm4.1 5.2 3.95×0.39 6.17×4.96 5.2 7.9 6.1
表三 酿酒酵母显微计数结果 各中格菌数/个 菌种 1 2 3 4 5 301 10 1.51×10 8A B 菌数/ml 酿酒酵母 65 40 70 52 74 六．思考题
1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须使用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 答：因为目镜和物镜组成的放大倍数不同,目镜测微尺每小格在不同条件
下所代表的实际长度也不一样，就必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正,这样的目镜测微尺测量的长度才是目前状态下的准确长度。
2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细
菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
答：理论上是应该相同的，因为目镜测微尺是同一个，标度是一样的，
用的不同物镜，目镜测微尺每格长度发生改变，同时，目镜测微尺的格数也会发生改变，但总的菌体长度不会发生改变。不过不可能完全一致，肯定会有误差，有观察者观察的误差，计算误差等等。
3．结合你的实验体会，总结哪些因素会造成血球计数板的计数误差，应如
何避免？
答：1.菌液必须要纯正且要混合均匀，在加样品前可先把菌液摇晃一下，.
以混合均匀。
2．要注意样品的浓度，太浓太稀均不合适。观察完原菌液后，根据
原菌液的浓度，做适当的稀释。
3．计数时选的五个中格一定要相互隔开。
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