图3 易错PCR示意图
Figure 3 Sketch of error-prone PCR
1．2.3 DAN重排
DNA重排(DNA shufling)技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，Stemmer于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先将同源基因(单一基因的突变体或基因家族)切成随机大小的DAN片段，然后进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板，经过多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。其操作的原理和步骤如图4。
图4 DNA重排的原理及操作步骤
Figure 4 The principle and operation process of DNA shuffling Zhao等在此基础上发明了一种更加简化交叉延伸程序( STEP)(图5)。此技术是在一个PCR反应体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在每一轮PCR循
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环中，那些部分延伸的片段可以随机地与含不同突变的模板进行杂交，使延伸继续，并由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，致使DNA重排方法进一步简化。
图5 交叉延伸程序的基本过程
Figure 5 Basic procedure of staggered extension process 近几年来，提高DNA重排技术捕获变异的能力一直是研究人员努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI对靶序列进行消化，发明了递减法建立杂交酶技术（ITCHY)，使得非同源性序列间也能发生重排，扩大了该技术的用途。Hiraga等开发的SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶识别标记，用相应的限制性内切酶代替DNase I产生重排片段。Bergquist等开发的DOGS技术则是根据保守模体区序列特征设计简并引物，扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此方法是在突变耐受的保守区直接增加转辙组的几率，所以其产生的突变频率大大增加。
DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以达到几万kb。通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。 1．2.4 基因组重排
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基因组重排(genome shufling)技术是受DNA重排的启发，于2l世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术，将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生)，即递归原生质体融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2002年首次报道应用基因组重排方法快速地使弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生泰乐菌素的能力得到提高。该方法以营养缺陷型为出发菌株，仅用了1年时间，通过两轮基因组改组就从24 000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株，其泰乐菌素产量高于通过经典诱变育种方法所筛得的生产菌株SF21，而后者(SF21)是用经典诱变育种方法在长达20年的时间中先后筛选过约1 000 000个菌株后才获得的。由此可见，此技术大大减少了工作量，并缩短了筛选时间。四川抗菌素工业研究所的徐波等以产量性状为标记特征，应用基因组重排的方法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3％。
除上述技术外，近年来又出现了一些新技术，例如：部分基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、瞬时模板的随机嵌合、单向引物的随机重组、自我复制、体外随机引发重组(RPR)、酶法体外随机-定位诱变(random—site—directed mutagenesis)、交错延伸剪接PCR等。 2、基因工程育种技术在大肠杆菌种的应用
大肠杆菌是迄今为止研究的最为详尽的原核细菌，其K-12MG1655株的4 000多kb的染色体DNA已测序完毕，全基因共含有4 405个开放阅读框，其中大部分基因的生物功能已被鉴定。作为一种成熟的基因克隆表达受体，大肠杆菌被广泛用于分子生物学研究的各个领域，如基因的分离扩增、DNA序列分析、基因的表达产物功能鉴定等。由于大肠杆菌繁殖迅速，培养代谢易于控制，大肠杆菌的分子遗传学背景已相当明了，不断完善的基因操作技术可将大肠杆菌构建成为用于异源蛋白生产的分子工厂。因此，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌，以规模化生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。现在已
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有100多种异源蛋白通过大肠杆菌基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂的人体蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工业中常用于生产医药蛋白如人胰岛素、人生长激素、人干扰素、人白细胞介素和抗体。以下以生产人干扰素为例介绍其应用。
人干扰素a2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165个氨基酸组成的多肽,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、修复DNA结构损伤等作用。hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等均具有治疗作用。大肠杆菌表达系统具有生长快速、发酵成本低、表达水平高等优点,是生产外源蛋白的理想表达体系。在大肠杆菌温度诱导表达外源蛋白的发酵过程中,如何控制升温诱导后菌体的生长,提高产物的比生产速率,是实现高密度高表达的关键。本文采用大肠杆菌BL21(pBAI)表达hIFNa2b,其表达通过温控型PL启动子调控。考察了补料方式对hIFNa2b生产速率的影响,hIFNa2b表达水平达到6 540 mg/L。
2.1 材料与方法 2.1.1 材料
菌株 宿主菌E. coli BL21(DE3)[BF-dcm ompT hsdS (r-Bm-B) galλ(DE3)],重组质粒为pBAI,带有氨苄青霉素耐药性标记,hIFNa2b基因表达受λPL启动子和质粒cI857编码的蛋白调控。
培养基 种子培养基为LB培养基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),灭菌后加入100 mg/L氨苄青霉素钠。分批发酵培养基为含葡萄糖5 g/L的LB培养基。未特别注明的补料分批发酵培养基均为含葡萄糖5 g/L的2×LB培养基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),补料液为400 g/L的葡萄糖。培养基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均为Oxoid产品,其余试剂为国产分析纯,采用去离子水配制。
2.1.2 培养方法
种子培养 从-20°C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入装有30 ml种子培养基的250mL锥形瓶,于摇床200 r/min,30°C下培养10 h,为一级种子;将一级种子以1.5%的接种量转接至装有70 ml LB培养基的500 ml锥形瓶中,相同条件培养9 h,为二级种子。
发酵罐培养 将二级种子以6%的接种量接入5 L发酵罐(RIBE-5型)中。培养
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液装量为2.5 L，生长阶段控制温度30°C,表达阶段控制温度42°C，发酵过程中控制pH为7.0,通气量4 L/min，初始搅拌转速为400 r/min,发酵过程中转速逐渐提高以维持溶氧大于20%。补料分批培养过程中,初始葡萄糖耗尽后采用3种不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供应速率流加。恒pH方式为当pH超过7.0时自动补入葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(L·h)的速率流加葡萄糖；恒比供应速率(QG)为0.27 g/(g·h)，每小时根据菌体浓度调整葡萄糖的流加速率。
2.1.3 测定方法
菌体浓度测定采用浊度法,测定波长600 nm处的光密度(OD600),根据标准曲线计算菌体干重。葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)测定。乙酸测定采用气相色谱法[5]。hIFNa2b的电泳测定采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(φ=0.15)-SDS-聚丙烯酰胺三层胶系统分离目的蛋白[6],凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分析系统(Smart View analysis program,上海复日科技有限公司)定量。取发酵液于12 000 r/min,4°C下离心10 min,得到的菌体用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0,4°C)洗涤,然后溶于上样缓冲液中[12mmol/L、pH 6.8 Tris-HCl,甘油(φ=0.05),SDS(7.5 g/L),巯基乙醇(φ=0.02),溴酚兰(0.5 g/L]。
2.2 结果与讨论 2.2.1 分批发酵
在5 L罐中分批培养,结果见图6和表1。培养2.5 h升温诱导,此时菌体处于对数生长期,升温对于菌体生长的影响并不显著,表达初期菌体比生长速率较升温前略有下降。分批发酵中葡萄糖耗完时,乙酸积累达到最大值1.1 g/L。hIFNa2b的表达水平达到749 mg/L,是相同培养基条件下摇瓶培养的2.9倍。诱导后1 h,hIFNa2b比生产速率为162 mg/(g·h),生产速率为275 mg/(L·h)；诱导后期比生产速率下降至95 mg/(g·h),但由于菌体浓度增大,生产速率达到363 mg/(L·h)。
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