图6 分批培养时菌体(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的变化曲
线
Fig.6 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■), acetic
acid (●) and hIFNa2b (▲) in batch cultivation
2.2.2 葡萄糖流加对于hIFNa2b生产水平的影响
要获得hIFNa2b的高体积表达水平,则需维持较高的比生产速率,并且增大菌体密度,流加葡萄糖是一种很好的选择。
恒pH流加葡萄糖 培养4 h后升温诱导表达hIFNa2b,此时残糖浓度为0.9 g/L。6 h时初始葡萄糖耗尽,溶氧迅速回升,开始用恒pH法补加葡萄糖,即pH高于设定值时蠕动泵自动加入葡萄糖溶液1 s。此补料分批发酵实验记为FB1,结果见图7和表1。升温诱导后,菌体生长明显减慢,升温后2 h菌体的比生长速率为0.425 h-1,与升温前的0.710 h-1相差很大,这与诱导时环境和细胞生理状态有关。与分批发酵相比较,升温诱导时(2.5 h)菌体处于对数生长前期,培养基中营养物质充分,而本实验中于4 h升温诱导时菌体处于对数生长后期,培养基中的营养物质已经被大量消耗,难以维持对数期的比生长速率。进入恒pH补料阶段后,菌体比生长速率下降的趋势进一步明显,发酵末期菌体比生长速率仅为0.025 h-1。
图7 恒pH补料分批培养(FB1)中菌体(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及
hIFNa2b(▲)的变化曲线
Fig.7 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■),acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in pH-statfed-batch cultivation (FB1) hIFNa2b表达量在11.5 h达到2 400 mg/L,是分批发酵的3. 2倍。诱导初期的2 h内,hIFNa2b比生产速率为148 mg/(g·h),生产速率高达730 mg/(L·h)。后期hIFNa2b表达速率明显减慢,发酵末期仅为10 mg/(g·h)。在恒pH补料分批培养中,
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能较好地控制葡萄糖的流加,使得发酵后期没有乙酸积累。但是恒pH流加方式下的葡萄糖流加是基于有机氮源的异化代谢引起pH上升,随着培养基的氮源如氨基酸的逐渐消耗,减少了氨离子的产生,从而不易引起发酵液pH上升,导致葡萄糖补加速率的降低,使得培养过程中特别是发酵后期葡萄糖的供应不足。如图8所示,培养过程中葡萄糖流加速率rG从2.83 g/h下降到1.99g/h,葡萄糖比消耗速率QG从0.115 g/(g·h)下降到0.087 g/(g·h),限制了hIFNa2b的表达。
与分批培养相比,虽然hIFNa2b的比生产速率有所下降,但总产量和菌体hIFNa2b含量大幅提高,说明菌体浓度升高有利于提高hIFNa2b表达水平,恒pH流加是一种操作方便的流加方式。
图8 恒pH补料分批培养(FB1)中葡萄糖浓度(■)、葡萄糖流加速率(◆)及葡
萄糖比消耗速率(▲)的变化曲线
Fig.8 Profiles of residual glucose(■), feeding rate of glu-cose (◆) and specific consumption rate of glucose(▲) in pH-stat fed-batch
cultivation (FB1)
恒速补料实验中hIFNa2b平均生产速率是恒pH补料时的1.65倍,表明葡萄糖供应的改善提高了hIFNa2b的表达水平,尽管葡萄糖的比消耗速率还是从诱导初期的0.28 g/(g·h)下降到0.21g/(g·h)。因为期望达到较高的菌体密度,所以生长期较长。诱导前培养基中营养物质消耗较多,8.5h时菌体的比生长速率已经降低到0.203 h-1,升温诱导后1 h,比生长速率更降低至0.074 h-1,营养消耗导致hIFNa2b的比生产速率仅27 mg/(g·h),大大低于恒pH补料分批培养实验FB1。通过恒速补糖方式取得了hIFNa2b非常高的表达量,但这是通过延长发酵时间和提高菌体浓度实现的,过低的比生产速率大大影响发酵生产效率。
2.3 诱导前添加有机氮源对hIFNa2b生产水平的影响
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许多基因工程菌外源基因的表达显示出与生长速率相关的特性,而补料分批培养中,随着菌体浓度的提高,诱导初期的比生长速率明显下降,反映了营养的限制。因此在诱导前1.5 h补充有机氮源(酵母提取物25 g),以满足菌体生长和产物合成的需要。初始葡萄糖耗完后,采用恒比供应速率(0.27 g/(g·h))的方式补充葡萄糖,发酵过程记为FB3,结果见图9和表1。
图9 补料分批培养FB3中菌体(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)
的变化曲线
Fig.9 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■), acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in fed-batch cultivation FB3 (yeast extract
was added at6.5 h)
采用恒比供应速率流加方式,葡萄糖流速根据菌体总量变化而变化,能够较好地满足细胞代谢及重组蛋白表达所需的能量需求,同时也避免了乙酸和残糖的积累,平均比生产速率为恒速流加时的2倍。可以看出,加入酵母抽提物,满足了菌体生长的需要,使得诱导前后均有较高的比生长速率,表达期平均比生长速率达到0.106 h-1。升温诱导5.5 h后,hIFNa2b表达量即达到5530mg/L,hIFNa2b最大比生产速率为124 mg/(g·h),hIFNa2b的平均生产速率大幅提高,达1 006 mg/(L·h)。分批发酵和不同补料分批发酵的实验结果归纳于表1。可以看出FB3添加的酵母提取物提供了氨基酸和核苷酸,有利于外源基因的转录和翻译,使hIFNa2b合成速率加快,hIFNa2b对于有机氮源的得率最高,是FB2的1.27倍,并且发酵周期仅13.5h,较FB2的20. 5 h大大缩短了时间,提高了hIFNa2b的生产速率,一次性添加有机氮源的操作也比较便捷,在生产上有一定的应用价值。
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1) DCW at the beginning of inductionb；2) DCW at the end of culture 3) During 1 h post induction；4) Overall productivity of hIFNa2b； 5) Overall specific productivity of hIFNa2b；6) HIFNa2b yield based on total complex nitrogen sources；7) Specific hIFNa2b production
3 结 论
目前hIFNα2b在临床的应用广泛,需求量大,但由于生产水平的限制,价格仍旧较高。本文通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。分批培养时乙酸积累,对hIFNa2b表达有一定抑制作用,流加葡萄糖的策略使得表达期无乙酸积累,提高了hIFNa2b的表达水平。不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6 540 mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5 200 mg/L。恒比供应速率流加葡萄糖并在诱导前添加酵母抽提物,虽然总表达量5 530 mg/L,稍低于恒速流加方式,但是平均hIFNa2b生产速率高达1 006 mg/(L·h),是分批培养时的3.08倍,是恒速流加方式时的1.84倍,并且对有机氮源的得率提高到138 mg/g,大大缩短了发酵时间,为该表达系统的实际应用创造了条件。
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