基因编码的光解酶 PHr 进行。 PHr 在黑暗是专一性地识别嘧啶二聚体,并与之结合,形成酶 -DNA 复合物,当给予光照时,酶利用光能( PHr 本身无发色基团,与损伤的 DNA 结合后才能吸收光,起光解作用)将二聚体拆开,恢复原状,酶再释放出来。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用,所以在进行紫外线诱变育种时,只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。
(2) 暗修复作用,又称切除修复。该修复系统除了碱基错误配对和单核苷酸插入不能修复外,几乎所有其他 DNA 损伤均可修复,是细胞内的主要修复系统,涉及到 UvrA 、 UvrB 、 UvrC 和 UvrD 四种蛋白质的联合作用。
另外还有重组修复、 SOS 修复等方式。 4、突变与育种 1)自发突变与育种
(1)从生产中选育。在日常的大生产过程中,微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。例如,从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的自发突变株。
(2)定向培育优良品种 是指在某一特定条件下,长期培养某一微生物菌群,通过不断转接传代以积累其自发突变,并最终获得优良菌株的过程。由于自发突变的频率较低,变异程度较轻微,故用此法育种十分缓慢。 2)诱变育种
诱变育种是通过人工方法处理微生物,使之发生突变,并运用合理的筛选程序和方法,把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。人工诱变与自发突变相比可大大提高微生物的突变率,使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变株,作生产和研究之用。 (1)诱变育种一般性原则
①挑选优良的出发菌株。出发菌株是指用于育种的起始菌株。有利性状:高产、生长速度快、营养要求粗放、产孢子早而多的菌株等。 ②选择简便有效的诱变剂。在选用理化因子作诱变剂时,在同样效果下,应选用最方便的因素;而在同样方便的情况下,则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中,尤以紫外线为最方便,而化学诱变剂中,以 NTG 最为有效。
③处理单孢子(细胞)菌悬液。在诱变育种中,所处理的细胞必须是单孢子或单细胞悬液状态。其目的是:一方面分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂;另一方面又可避免长出不纯菌落。在某些微生物中,即使用这种单细胞悬液来处理,还是很容易出现不纯菌落,这是由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的原故。
④选用最适剂量。各种诱变剂有不同的剂量表示方式。剂量一般指强度与作用时间的乘积。化学诱变剂常以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。
⑤充分利用复合处理的协同效应。 ⑥设计或采用高效筛选方案或方法。
筛选方案:在实际工作中,一般认为应采用把筛选过程分为初筛
与复筛两个阶段的筛选方案为好。前者以量(选留菌株的数量)为主,后者以质(测定数据的精确度)为主。
筛选方法:初筛可在平板上进行,也可在摇瓶中进行,两者各有利弊,复筛必须在摇瓶中进行,并作精确测定。 5、基因重组
凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起,经过遗传分子间的重新重组合,形成新遗传型个体的方式,称为基因重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下,也能产生新遗传型的个体。 基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本。因此比诱变育种前进了一大步。同时也可消除某一菌株长期诱变导致产量上升缓慢现象。因此它是一种重要的育种手段。
1)原核微生物的基因重组。主要包括转化、转导(普遍性转导、局限性转导)、接合、原生质体融合。
2)真核微生物基因重组。在真核微生物中,基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。 6、基因工程
基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工,即把分离到的或合成的基因经过改造,插入载体中,导入宿主细胞内,使其扩增和表达,从而获得大量基因产物,或者令生物表现出新的性状。基因工程是在 20 世纪 70 年代开始出现的,三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础,这三项技术是: DNA 的特异切割、 DNA 的分子克隆和
DNA 的快速测序。这项技术使人类能定向改造基因,编码特定蛋白,从此人类获得了主动改造生命的能力。目前一些基因工程产品如人胰岛素、生长激素、干扰素、 DNA 疫苗、工程植物等。基因工程巨大的经济潜力和开发前景将使其成为本世纪的一个宠大的产业。基因工程的基本操作:
①目的基因获得。获得基因的方法有化学合成法、基因文库法(指某生物染色体基因组各 DNA 片段的克隆总体)和 cDNA 文库法(指某生物全部 mRNA 的 cDNA 克隆总体)。
②载体的选择。载体在细胞中能进行独立自主地复制;必须具有若干限制酶的单一切割位点,便于外源 DNA 的插入;载体必须具有可供选择的遗传标记。主要载体有:质粒载体、λ噬菌体、柯斯质粒载体、 M13 噬菌体载体、真核细胞的克隆载体、人工染色体等。 ③目的基因与载体DNA 的体外重组。通过限制性核酸内切酶的作用来进行
④重组载体引入受体细胞。通过转化、转染、转导、显微注射、电穿孔法等方式被导入细胞中去。
⑤重组体克隆筛选。通过菌落特征或噬菌斑等方法
⑥对克隆的基因进行鉴定或测序。遗传检测法、核酸杂交法、免疫化学法、物理检测法等 ⑦控制外源基因的表达。
⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。 7、菌种的衰退、复壮和保藏
在微生物的基础研究和应用研究中,选育一株理想菌株是一件艰苦的工作,而要保持菌种的遗传稳定性更是困难。菌种退化是一种潜在的威胁,因此引起人们的研究与重视。 1)菌种退化现象
菌种退化( degeneration )是指群体中退化细胞在数量上占一定数值后,表现出菌种生产性能下降的现象。造成菌种退化的原因主要有自然突变和环境条件。环境条件对菌种退化的影响,如营养条件,有人把泡盛曲霉的生产种,在 3 种培养基上连续传代 10 次,发现不同培养基和传代次数对淀粉葡萄糖苷酶的产量下降有不同影响,说明营养成分影响菌种退化的速度。环境温度也是重要的作用因素。例如,温度高,基因突变率也高,温度低则突变率也低,因比菌种保藏的重要措施就是低温。其他环境因子,如紫外线等诱变剂也可加速菌种退化。
2)衰退的防止。①控制传代次数;②创造良好的培养条件;③利用不同类型的细胞进行接种;④采用有效的菌种保藏方法。 3)退化菌种的复壮。因为在退化的菌种中仍有一些保持原有菌种特性的细胞,故有可能采取一些相应措施,使这些细胞生长、繁殖,以更新退化的菌株,称之为菌种的复壮。常用方法是①纯种分离;②通过宿主体内生长进行;③淘汰已衰退的个体。 4)菌种的保藏
经诱变筛选、分离纯化以及纯培养等一系列艰苦劳动得到的优良菌株,能使其稳定地保存、保持原有的特性、不死亡、不污染,这