就是菌种保藏的任务。 (1) 原理
人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧 3 方面设计。
（2）常用方法
菌种的保藏方法多样，采取哪种方式，要根据保藏的时间、微生物种类、具备的条件等而定。几种常用的保藏方法主要有斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、冷冻干燥保藏法。 另外还有悬液保藏法、寄主保藏法、液氮保藏法等。
二、撰写课堂报告的目的
1、了解微生物遗传变异和育种、菌种保藏的相关知识； 2、明晰利用遗传变异基本知识选择微生物菌株选育方法体系； 3、学会获取高产微生物生产菌株的研究方法。 三、撰写课堂报告的思路
通过对微生物遗传变异及育种相关知识的学习，以高产蛋白酶微生物菌株选育为科学问题，分析可用于高产蛋白酶菌株筛选的不同方法的差异，根据高产蛋白酶菌株筛选的要求，选择可组合使用的筛选方法组合，构建高产蛋白酶微生物菌株选育的方法体系。 四、课堂报告的正文 1、蛋白酶简介
蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂, 占酶制剂市场的65%以上，广泛用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业。按最适反应pH 分，蛋白酶可分为碱性，中性蛋白酶和酸性蛋白酶。碱性蛋白酶的最适反应pH 一般大于9.0，是当前市场上最为广泛使用的蛋白酶。微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为生物酶的重要来源。
以碱性蛋白酶为例，其产生菌有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌和霉菌。我国用于工业化生产的蛋白酶菌种主要有：地衣芽孢杆菌2709、地衣芽孢杆菌C1213以及短小芽孢杆菌289和209。产碱性蛋白酶的放线菌较少，主要是链霉菌(如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)，产生的碱性蛋白酶耐高温，很适合于工业生产。近二十年来， 研究人员对低温碱性蛋白酶的研究取得较大进展，研究发现，产低温碱性蛋白酶的微生物主要有假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、异单孢菌属、耶尔森氏菌属、希瓦氏菌属等。
2、蛋白酶合成中心法则
中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能
以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充和发展。
3、蛋白酶高产菌株的选育方法分析与选择
以碱性蛋白酶菌株选育为例，分析选育方法如下： （1）自然选育技术。自然选育利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。自然选育步骤：通过表现形态（菌落大小，生长速度，颜色，孢子形成）来淘汰不良菌株；通过目的代谢产量的考察。；进行遗传基因型纯度试验；传代稳定性试验
（2）诱变筛选技术。利用物理、化学诱变剂单独或复合处理原始菌株。迄今仍是蛋白酶育种的有效方法之一。国内较为典型的有中国科学院微生物研究所那淑敏等人于1987年利用亚硝基胍和紫外线复合处理、获得了产酶活力比出发菌株提高了近20倍的变异株。薛林贵等通过紫外诱导的方法得到一株产酶为22080 U/ml的突变体。梅承芳等人以分离自碱湖的产碱性蛋白酶菌V．metschnikoviiDL33为出发株，经紫外线、硫酸二乙酯多次复合诱变，获得一高产突变株
V．metschnikoviiDL33-51，其产生的碱性蛋白酶活力是出发菌株的5.74倍，48h发酵液酶活由350 U/mL提高至2010 U/mL。
（3）原生质体技术。新近发展起来的原生质体技术，对实现有效的遗传育种提供了很大的方便，通过诱变、融合原生质体或原生质体的诱变融合相结合来改变菌种的遗传特性。原生质体融合可使双亲遗传物质在融合子中发生随机的多种整合。从而导致杂合子集双亲性状于一体，通过定向筛选，有可能得到带目的性状的整合体，且性状因具备传代的物质基础而得以稳定的遗传下去，经实践证明，这是一种有效的遗传育种技术。薛林贵等人对地衣芽孢杆菌53号菌株在原生质体形成最佳条件下进行原生质体制备并多次紫外线诱变终得一株稳定高产的碱性蛋白酶产生菌53-G38-6，酶活力比原始菌株提高了近20倍。
（4）蛋白质工程技术。蛋白质工程是指通过天然蛋白质或蛋白质衍生物的结构分析，确定其三级结构模型，然后通过分子设计合成突变基因，经筛选突变体DNA，合成相应蛋白质的方法。其研究主要集中在提高碱性蛋白酶的稳定性，抗氧化性及改变蛋白酶的专一性等。我国在蛋白质工程技术选育高产碱性蛋白酶菌株取得了重大成就。王贤舜用蛋白质工程的方法在计算机图像系统上对预定的分子改造方案进行了预测，成功地完成了构建1个分泌热稳定性比野生型枯草杆菌蛋白酶高4倍的工程菌。
（5）基因工程技术。利用基因工程技术手段提高菌种的产酶能力， 不仅使菌种的产酶量有极大地提高， 而且能够改变酶的某些特
性以求满足生产需求， 促进了理论研究与实践应用的紧密融合，大大缩短了从探索研究到生产应用的周期，同时也克服了传统菌种选育方法的随机性和盲目性，为微生物育种提供了一条新的思路和途径。王培之等成功利用遗传工程的方法构建一个分泌型高表达的枯草杆菌碱性蛋白酶E的枯草杆菌质粒——宿主系统。刘永亮等利用枯草杆菌碱性蛋白酶E基因的信号顺序构建分泌表达载体获得成功。
结合我们的研究实际，拟主要采用诱变筛选的方法来进行高产蛋白酶菌株的选育研究。
4、蛋白酶高产菌株的选育方法体系体系构建 1）高产原始菌株的获取
菌种分离的流程如下：标本采集 →纯种分离→菌种初筛→菌种复筛→菌种保藏
①采样
采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
②纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
③菌株初筛：分别用无菌牙签将各株芽孢杆菌点种于酪素培养基平板中，每个菌株做3-4个重复，置37℃培养24h 后，观察平板上