8.选择打分高的，且退火温度在55℃左右的温度。
9.可通过手动调节上面的序列，使得二者的打分最高，如退火温度较高，则可以把序列长度降低一点，如19，点击Edit Primer --可以把引物序列复制下来
引物的基本原则
1.引物的长度18-28，不能太长。引物越长特征性高，要求的退火温度越高，但是扩张效率较低，容易形成引物二聚体。
2.G、C的含量在45-55%左右，但有时也可能比较高或者比较低，不是很重要，45-55%的范围只是最好的。G、C含量高，退火温度高。 3.3’端是最重要的，是起始阶段。最好是A、T、C、G随机均一分布，不能集中的分布；特别3‘端前段最好不要连续3个以上的G、C出现，不能很好的促发反应，只要3’端的前10个碱基结合得好就行。5‘不是很重要，可以很多不配对。实际上3‘端连续出现G/C但是效果也比较好。
GCCTCGTCCCGTAGACAAAAT
CCAGGGGGGCTAAGCAGTT
10.
11.外套和内套的设计 使得特异性更高 要没有false priming 打分不一定都要100分 退火温度在55度以上都行 内套序列必须位于外套内
设计外套228-818 sense CACGGCAAGTTCAACGGCAC Anti -Sense TTTCTCCAGGCGGCAGGTCAG 设计内套 310-585
Sense CTGCCAACATCAAGTGGGGTG Anti -sense GTCCCTCCACGATGCCAAAG 一般先用外套引物进行扩增，再用内套引物扩增。 12.设计交叉序列的引物（温度相差不超过5度）
注意 ;这两个引物必须包括整个序列的90%以上的序列。 31-944
Sensse CCGTAACTTCTGTGCTGTGCCA
Anti sense AGAAGAGTGAGTGTCGCTGTTGAAGT 226-1029
Sense GCAAGTTCAACGGCACAGTCAA Anti -sense TGCTGTAGCCAAATTCATTGTCGTA
13.双重PCR设计 同时进行两个PCR扩增 两对引物之间碱基序列相差100左右 31-247 63.5-63.5 100分
Sense CCGTAACTTCTGTGCTGTGCCA Anti-sense TTGACTGTGCCGTTGAACTTGC 311-628 87分 62.1-62.4
Sense TGCCAACATCAAGTGGGGTG
Anti -sense ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT
14.上游引物试剂盒已知的：如规定退火温度在73.2℃，则设计下游引物序列的温度在73℃左右，最好一样，不能超过或者少于2℃，可以改变引物长度提高退火温度，但是最高不能超过26 外套位点464
Anti-sense CATCACAAACATGGGGGCATCGGC 内套位点101
Anti-sense GCCGAATCCGTTCACTCCGACCTT
注意：关键不能错配，如果有错配可以看下错配的位点，如果和引物是反向不相交的，则不需考虑。