CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群 CD19/或CD20圈定B淋巴细胞 CD56圈定NK淋巴细胞 CD14圈定单核细胞
2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体
3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞 4、激活剂
① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）
A. DMSO中调节浓度0.1mg/mL
B. 分装(20?L)，－20℃储存。勿反复冻融
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液 D. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液
② Ionomycin （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）
A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL B. －20℃储存
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液 D. Ionomycin终浓度1?g/mL细胞悬液
③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)
A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL B. 4℃储存
C. SEB终浓度10?g/mL细胞悬液
④ CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞 ⑤ CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml 5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内 ① Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）
A. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
B. 分装(20?L)，-20℃储存。勿反复冻融。 C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液 D. 激活最后4－5小时BFA终浓度10?g/mL细胞悬液。 注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降 ② Monensin （eBioscience，目录号00-4505） 6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、 固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222） 8、 破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）
将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合
9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法
细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法 检测细胞因子 人IFN-? 人TIMP-1 人TNF-? 人IL-1? 人IL-1? 人IL-2 人IL-4 人IL-5 人IL-6 人IL-10 人IL-12 人IL-15 人Fractalkine/CX3CL1 人IL-8/CXCL8 人MCP-1/CCL2 人MIP-1?/CCL3 人MIP-1?/CCL4 人RANTES/CCL5 小鼠IL-2 小鼠IL-4 小鼠IL-5 阳性对照刺激方法 方法2 (4-24 小时) 方法5 方法7 (6 小时) 方法3 (6 小时) 方法3 (24 小时) 方法2 (4-24 小时) 方法4 方法1 单核细胞：方法3 (6-12 小时) T细胞：方法6 方法1 方法8 方法3 方法1 方法3 (24 小时) 方法3 (24 小时) 方法3 (24 小时) 方法3 (24 小时) 方法1 方法9 方法10 方法10 小鼠IL-6 小鼠IFN? 小鼠TNF-? 方法11 方法9 or 方法12 方法9 为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)
方法1: 只使用转染细胞检测
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.
方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时
方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1? (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN? (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFN? (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时
方法10: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时 方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时
六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）
1、 收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时
2、 阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色
① 在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。
② 对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断 3、细胞表面染色
① 加适当的细胞表面染色试剂20?L于Falcon管中，加入100?L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；
② 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）
③ 离心500g 5分钟，弃上清 4、固定和破膜
① 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清； ② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书） ③ 加2?3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。 5、细胞内染色
① 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。
② 加2?3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500?LPBS上机或加入500?L 1% PFA固定后再上机
七、注意事项
1. 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制
钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
2. 刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时
间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析
3. 选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：
① 未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生 的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
② 激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，
制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
③ 同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
4. Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠
可以用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
5. 荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标
记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ
八、问题与解答
问题 原因 解决 激活剂制细胞未激活 注释 PMA+Ionomycin备不当，见激激活4小时后CD3+T淋活剂制备储存巴细胞CD69阳性率一节。 应使用肝素钠，不要使用肝素锂，避淋巴细胞激活需要应>90% 无CD69胞内染色 使用了错误的抗凝剂 免使用ACDCa，络合Ca的抗凝剂会与EDTA等络影响激活。 合钙的抗凝剂。 在使用通细胞未通透 透液前先使用溶血素 详见BFA制备BFA于-20℃储存 溶血素辅助细胞通透 BFA失活或制备不当 详见BFA制备