胞内染色阳性但很弱 抗细胞因子抗体浓度不对 通透后细胞在胞内染色前未洗 荧光单抗不纯或荧光与抗体结合不牢导致异结合 按R&D光抗体 按操作程序通透后洗细胞再胞内染色 正常的激活T淋巴应使用PE或APC标记
使用试剂阻断Fc受推荐量使用荧细胞IL-4表达通常<2%，使用体可以有效减少非特异体阻断节 解析出的荧光染料非特R&D 试剂 荧光染色，详见Fc段受背抗体与固定后的胞使用 按推荐剂量 按对照Ig浓度过高 R&D 景染色内抗原亲和力低，需提R&D试剂并太高 高抗体浓度。 错误的同型对照，推荐量使用R&D匹配的同型对照试剂 严重的细胞损失 洗涤离心步骤丢失细胞 加样步骤丢失细胞 固定通透500g 弃上清带走细胞 按操作步溶血不完全 PMA+Ionomycin骤用FL3做阈激活 值去除碎片和未溶细胞 溶血未在室温进行
Th1/Th2细胞研究方法
在室温进行溶血 固定后细胞密度低心。 小心吸样 PMA可稳定红细胞膜，PMA+I激活全血较难溶 的细胞离心于活细胞，需用高转速离尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现，在外周血白细胞中，
除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。
根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应，在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应。近几年来研究发现，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等，而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克服了传统方法所得结果为整个群体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反应的不足，通过表面染色多参数分析可以区分表达特定细胞因子的细胞亚群。一般用CD3+/CD4+ 或CD3+/CD8-作表面标记，选择相应的荧光标的抗体，Th1和Th2细胞分泌细胞因子的情况如下：
全血标本经过刺激培养、表面标记、
固定、破膜、胞内染色（IQ，Cytodetect?kit(basic)，CAT方法，IQP-367）后结果如下：
正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值
一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小时后，按照操作程序测得参考值如下： 细胞因子 IL-2 IL-4 IFN-γ TNF-α
第四部分 流式细胞术分析血小板
流式细胞术分析血小板
血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。
阳性细胞（均数%） 35.5 1.6 24.9 23.3 阳性细胞（范围 %） 25.0-41.5 0.7-2.2 18.0-31.7 13.6-35.9 一、流式细胞仪血小板分析应用范围
1. 通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。 2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷。
3. 结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。
4. 发现血小板抗体，做定性和定量分析。
二、血小板分析的临床意义
1. 血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。
2. 血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍 3. 贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。
4. 血小板减少性疾病：破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体（PAIg）是反映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定104甚至103个血小板，在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有关，全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样，检测分泌到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。“
5. 血小板储存与输注：用P-选择素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物，发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。储存5天以上，
40%～60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化，但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。
6. 抗血栓药物的监测：活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。 7. 此外，全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，测定严重血小板减少患者的血小板数目。
三、流式细胞仪分析全血中血小板的优点 1. 全血中血小板更接近生理状态。
2. 操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变(如血小板活化试验)。 3. 同时检测血小板的多个标志物，结合FSC和SSC，评估多个参数，进行定量分析。
4. 多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰。
5. 检测血小板亚群灵敏度高。 6. 用血量少。 7. 无放射性污染。
四、全血样本的制备
1．抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。
2．Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。 3．1%多聚甲醛固定样本。 4．上机检测
五、质控标本
1. 阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。
2. 血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。
3. 血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。 4. 血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，