高效液相色谱与微超滤技术联用化学发光检测人体血清中的盐酸多巴酚丁胺
第32卷分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告第6期 高效液相色谱与微超滤技术联用
化学发光检测人体血清中的盐酸多巴酚丁胺
张迎雪1,2 陈福南1 章竹君31
12(西南师范大学分析科学研究所,重庆400715) (琼州大学,五指山572200)
摘 要 研究发现,盐酸多巴酚丁胺在碱性条件下能大大增强Luminol2K3Fe(CN)6化学发光强度,基于此,并结合HPLC分离技术,建立起盐酸多巴酚丁胺的HPLC2CL分析新方法。在C18反相键合相为色谱柱,乙腈为流动相的条件下,实现了对人体血清中的盐酸多巴酚丁胺的分离与测定。方法的线性范围为1.0～100μg/L,相关系数为0.9995;检出限为0.76μg/L;相对标准偏差为2.9%(n=11)。
关键词 高效液相色谱,超滤,化学发光,人体血清,盐酸多巴酚丁胺
1 引 言
盐酸多巴酚丁胺(dobutaminehydrochloride)属儿茶酚胺类β肾上腺素受体激动药,能增强心肌收缩力,增加心脏排血量,对心肌梗塞后和心脏外科手术时处于休克状态的病人有较好的疗效,特别是其改善左心室功能的作用优于多巴胺1。测定盐酸多巴酚丁胺的方法主要有分光光度法2、伏安法3和高效液相色谱法4,5,尚未见采用化学发光法与高效液相色谱联用技术检测盐酸多巴酚丁胺的报道。
化学发光法(chemiluminescence)因其具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单等优点而倍受关注。化学发光(CL)检测技术与高效液相色谱(HPLC)相结合,能较好克服化学发光选择性差的弱点,因而使得HPLC2CL成为一种有效的痕量及超痕量分析技术。研究发现,铁氰化钾与Luminol在碱性介质(NaH2CO3/NaOH缓冲溶液,pH=9.6)条件下,所产生的微弱的化学发光,能被盐酸多巴酚丁胺大大增强,且发光强度与盐酸多巴酚丁胺在一定浓度范围内呈线性关系;以乙腈作为流动相,基线稳定,脉动小,且使样品能达到基线分离。基于此,结合微超滤采样技术建立了测定人体血清中的盐酸多巴酚丁胺的HPLC2CL新方法,检出限为0.76μg/L,线性范围为1.0～100μg/L,相关系数r=019995。对1.0×10-8g/mL的盐酸多巴酚丁胺平行测定11次,得该方法的相对标准偏差为2.9%。与其它方法相比,本法操作简单,不需程序洗脱,实验时间短,灵敏度高,在选择性和适用范围等方面也具有明显的优势。2 实验部分
2.1 仪器和试剂
D27000型高效液相色谱仪(日本日立公司);C18色谱柱;HL22恒流泵(上海沪西仪器厂);IFFM2A型微弱化学发光分析仪(西安瑞迈电子科技有限公司),微超滤管(VIVASPIN100μL)。
盐酸多巴酚丁胺标准溶液:0.2mmol/L,配于100mL棕色容量瓶中,作为储备液,使用时稀释至所需浓度;1.0×10-5mol/LK3Fe(CN)6溶液;Luminol配成浓度为1.0×10-2mol/L储备液,实验时稀释成1.0×10-4mol/L溶液(用NaHCO3/NaOH缓冲溶液配制pH=9.6);乙腈(一级色谱纯);血清样品由西南师范大学医院化验室提供。其余试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。
2.2 实验方法
按图1装置操作,待基线稳定后,取盐酸多巴酚丁胺的标准溶液和样品溶液40μL进样(高效液相色谱仪自带20μL采样环),记录仪记录化学反应的发光信号,以相对峰高定量。图1中以蠕动泵方式在3通道中分别引入乙腈(100%)、1.0×10-5mol/LK3Fe(CN)6溶液和1×10-4mol/LLuminol溶液。2003204213收稿;2003212201接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No.20175039)
高效液相色谱与微超滤技术联用化学发光检测人体血清中的盐酸多巴酚丁胺
3 结果与讨论
3.1 发光条件的选择
3.1.1 Luminol溶液浓度及缓冲溶液pH值的影响
Luminol作为化学发光试剂,其浓度高低直接影
响化学发光强度。实验中详细研究了其浓度对化学
发光信号的影响,发现发光强度随着Luminol浓度的
增加而增大;但其浓度超过1.0×10-4mol/L时,基
线迅速升高,且波动较大,发光信号不很稳定,峰高
值难以定量。因此,在本实验中选择Luminol浓度为 图1 高效液相色谱化学发光分析系统示意图1.0×10-4mol/L。Luminol在碱性条件下(pH>9)Fig.1 Schematicdiagramofhighperformanceliquid能稳定存在,铁氰化钾在碱性条件下才能发挥其强chromatography(HPLC)2chemiluminescencesystem的氧化性。实验中考察了NaHCO3/NaOH缓冲溶液
pH值从9至12对化学发光信号的影响,发现随pH
值增加,发光强度增大;但pH值大于9.6时,发光强度增加缓慢而基线升高显著;当pH值大于10.7时,发光强度反而减弱(见图2)。所以,本实验选择Luminol缓冲溶液的pH值为9.6。
3.1.2 铁氰化钾浓度的影响 铁氰化钾作为氧化剂,其浓度的大小对化学发光强度的影响至关重要。实验发现,发光强度随铁氰化钾浓度的增加而增大;但当铁氰化钾的浓度超过1.0×10-5mol/L时,在较大范围内发光强度没有显著变化(见图3),原因是铁氰化钾本身对光有吸收,其浓度高时吸收光的能力增强,从而使发光强度减弱。因此,本实验选择铁氰化钾的浓度为1×10-5mol/L
。
图2 pH值对发光强度的影响
Fig.2 EffectofpHonthechemiluminescence
intensity 图3 铁氰化钾浓度的影响Fig.3 EffectofK3Fe(CN)6concentrationonthechemi2
luminescenceintensity
3.1.3 蠕动泵流速的影响 铁氰化钾氧化Luminol
反应是一个快发光反应,二者混合后立即发光。实验选定样品与铁氰化钾、Luminol溶液混合后的三通距流通池为4.0cm(流通池内径为2mm)的条件下,蠕动泵流速为1.8mL/min时,可检测到最大发光信号。
3.2 色谱条件的选择
3.2.1 流动相的选择 研究了高效液相色谱常用流动相甲醇和乙腈对化学发光反应的影响,发现两者对发光反应均有一定的抑制作用。甲醇对Luminol2K3Fe(CN)6化学发光抑制作用虽然很弱,噪声较大,使仪器灵敏度降低,且对盐酸多巴酚丁胺洗脱不彻底,柱外扩散现象严重,不能达到基线分离。乙腈在此化学发光体系中优于甲醇的流动相,可使信噪比大大增强,信号的基线稳定,保留时间短,样品能达到基线分离。我们对一系列乙腈水溶液(体积比分别为:0%、20%、40%、60%、80%和100%)作为流动相的条件进行了优化,发现100%乙腈对样品的分离效果最好,故选择纯乙腈作为流动相。
3.2.2 盐酸多巴酚丁胺的色谱行为 当高压输液泵泵速为1.0mL/min,乙腈作为流动相时,浓度为1μg/L的盐酸多巴酚丁胺色谱图如图4所示,保留时间为2.92min。