微生物课程实习方案
一、样品的采集处理方法
1.遵循的原则：第一，采集的样品要均匀一致、有代表性，能够反映被分析食品的整体组成、质量和卫生状况；第二，在采样过程中，要设法保持原有的理化指标，防止成分逸散或带入杂质。 2.采样的方法
因为本组所进行实验的材料是腐竹，属于无包装的散装样品，对于无包装的散堆样品，其取样方法如下：
一般按三层五点法进行代表性取样。首先根据一个检验单位的物料面积大小先划分若干个方块，每块为一区，每区面积不超过50cm2 。每区按上、中、下分三层，每层设中心、四角共五个点。按区按点，先上后下用取样器各取少量样品；再按四分法处理取得平均样品。
二、预计时间安排
1.2011/12/16——12/18:查阅资料，写好实验方案
2.2011/12/19：给老师检查实验方案，并进行修改。领取实验器材，并清洗实验器材，做好准备工作。
3.2011/12/20——12/25：进行腐竹中酵母菌和霉菌的数目检测实验。
4.2011/12/26——12/30：进行腐竹中细菌的检测实验和大肠杆菌的定性实验 5：预计酵母菌和霉菌大概培养5天，预计细菌大概培养3天，在这期间每天上、下午定时进行观察，并记录菌落的生长状况。
三、注意事项
1.细菌的培养在三栋105 2.酵母菌的培养在三栋108
3.每次使用完高压灭菌锅和超净工作台后写明时间，组别（写组长的名字）。 4.称量样品时必须在108，即无菌室那边。
5.每个实验前应该把移液管，试管，三角瓶，以及培养皿洗好并灭菌。
腐竹中酵母菌数目检测
一.实验目的
采取分离培养方法检测腐竹中细菌数目。
二.实验器材
研钵一个，500mL量筒1个，滴定管1根，1 mL吸管4根，试管4根，玻璃棒2根，培养皿12个，500mL烧杯一个，涂抹棒1根，洗耳球1个，牛角匙2个，瓷杯1个，漏斗，橡皮管，铁夹1套，铁架台1个，电磁炉1个，天平1台，pH试纸，250mL三角烧瓶3个，标签纸2张，纱布，棉花，棉线若干，高压蒸汽灭菌锅一台，恒温培养一台，超净工作台。
三.实验药品
马铃薯，葡萄糖，琼脂
四.检验程序
注：采用涂抹平板计数法
先在每一灭菌平皿倾注15mL左右固体培养基，制成平板，做好标记，每个稀释度做3个平行，然后用无菌吸管吸取0.2mL样品稀释液对号接种在不同稀释度的琼脂培养皿上，然后分别用无菌玻璃涂布棒将稀释液涂布均匀，平放桌上20-30分钟，使稀释液渗透于培养基中，然后将培养基倒置，28℃培养，3天后计数。
注：在酵母菌的培养期间，安排组员每天上、下午定期来进行观察菌落的生长情况，并详细记录好每次观察到的现象。 五.实验步骤
1、 样品的预处理及稀释
1.1、 固体和半固体样品：以无菌操作取25g 样品，置盛有225 mL 无菌水的无菌研钵内，再转移至500ml烧杯中，充分振摇，即制成1:10 的样品匀液。 1.2、 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCI调节。
1.3、 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL无菌水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
1.4、 按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
1.5 、根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），【根据对腐竹的污染情况估计可选取10^-2、10^-3、10^-4三个稀释度】在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做3个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。（注：每个稀释度做三个平皿的好处在于有利于排除错误的平皿，单数量的平皿也有利于选取中间菌落数，防止一大一小是不好取舍，使得数据更加准确）
1.6、 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2、培养
待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。
3、 菌落计数
肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌。以菌落形成单位（colonyorming units，CFU）表示。
选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态计数酵母菌，为白色菌落、比细菌菌落大几倍到几十倍。菌落数应采用两个平板的平均数。
4、结果与报告
（1） 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 （2）若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
（3）若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（4） 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算；
如为原液，则以小于1计数。
六.培养基的制备
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） 配方：欲配制500ml的培养基
马铃薯150g、葡萄糖（或蔗糖）10g、琼脂10g、H2O 500 mL、pH 6.5。
PDA培养基配制方法
马铃薯（去皮、去芽眼）→切成片（玉米大小）→称取150g＋500mL H2O→煮沸15-20min →双层纱布过滤→取滤液并补足500mL＋琼脂→熔化＋其它营养物质→调节pH（用HCl或NaOH）→分装试管→塞上棉塞→捆扎→灭菌（高压蒸气灭菌15-30min）→制成斜面→检查灭菌效果（即28~30℃培养2~3d）
七.实验记录 稀释度1 稀释度2 稀释度3 培养皿1 培养皿2 培养皿3 平均菌落数（个） 预计5天完成
腐竹中霉菌数目检测
一.实验目的
采取分离培养方法检测腐竹中细菌数目。
二.实验器材
研钵一个，500mL量筒1个，滴定管1根，1 mL吸管4根，试管4根，玻璃棒2根，培养皿12个，500mL烧杯一个，涂抹棒1根，洗耳球1个，牛角匙2个，瓷杯1个，漏斗，橡皮管，铁夹1套，铁架台1个，电磁炉1个，天平1台，pH试纸，250mL三角烧瓶3个，标签纸2张，纱布，棉花，棉线若干，高压蒸汽灭菌锅一台，恒温培养一台，超净工作台。
三.实验药品
孟加拉红培养基，琼脂
五.检验程序
注：在霉菌的培养期间，安排组员每天上、下午定期来进行观察菌落的生长情况，并详细记录好每次观察到的现象。
五.实验步骤
1、 样品的预处理及稀释
1.1、 固体和半固体样品：以无菌操作取25g 样品，置盛有225 mL 无菌水的无菌研钵内，再转移至500ml烧杯中，充分振摇，即制成1:10 的样品匀液。 1.2、 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCI调节。
1.3、 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL无菌水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
1.4、 按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
1.5 、根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），【根据对腐竹的污染情况估计可选取10^-2、10^-3、10^-4三个稀释度】在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做3个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。（注：每个稀释度做三个平皿的好处在于有利于排除错误的平皿，单数量的平皿也有利于选取中间菌落数，防止一大一小是不好取舍，使得数据更加准确）