实验二 氨其酸的纸色谱
一、 实验目的
1、学习色谱法分离的原理和类型。
2、学习用纸上层析法进行分离鉴定氨基酸的操作。
二、 实验原理
色谱法是利用混合物中各组分在同一物质中的吸附、溶解或者分配性能的不同，使混合物溶液流经该物质，经反复地吸附或分配等作用将各组分分离的一种操作方法。
纸色谱法是属于分配色谱的一种通常用特制的滤纸如新华一号滤纸作固定相（水为支持剂），含有一定比例的水的有机溶剂（展开剂）作流动相，应用于多官能团或高极性化合物如糖或氨基酸的分离鉴定。
圆形纸层析是纸层析的一种。方法是用一张圆滤纸，将样品点在圆心的位置或距圆心而作的同心圆的圆周上，在滤纸中心插一纸芯，使溶剂沿滤纸芯从圆心向滤纸的四周展开，由于样品组分在固定相和流动相之间的分配不同，使得易溶于流动相中的组分，随着溶剂的展开在滤纸上移动得快一些，而在固定相中溶解度大的组分移动就慢一些，因此得到分离（图2-35（1））。
Rf值：
Rf值是表示被分离的物质在层析图谱上的位置。
Rf = 原点到层析斑点中心距离 / 原点到溶剂前沿的距离 原点：为点样点的位置
溶剂前沿：展开结束时溶剂达到的位置 层析斑点：展开后，组分所达到的位置 如图1样品中组分一的Rf = OA / OC 组分二的Rf = OB / OC
Rf值取决于被分离条件物质在两相间的分配系数和两相间的体积比。在同一实验条件下同一物质Rf值是一常数。所以Rf值也是判断物质的主要物理常数之一。但影响Rf的因素很多，因此在进行纸层析的操作过程中，必须严格控制条件，否则Rf值不易重现。
在圆形纸层析中层析图谱显色后为弧形色带。Rf值最大的样品，其弧形色带距原点最远，最小的距原点最近，其余的便按序介于这二者之间。
注：滤纸本身是纤维素，纤维素分子上有许多羟基，羟基具有吸附水分的作用，纤维素的羟基能够和6-7%的水以氢键结合，即使把滤纸烘干，也很难把水分除去，所以滤纸外观上是干的，但实际上是含有水的，把干滤纸放在饱和的湿气之中，能吸附20%左右的水分。
三、 实验步骤
取圆形滤纸一张，直径要比用作层析的培养皿大2cm左右。用圆规自滤纸圆心处以1cm为半径划一圆（划圆时不可折叠滤纸）。将此圆之圆周分成三等分，并在滤纸边缘上对应地每一等分用铅笔标上谷、酪、混字样。
将滤纸平放在干净而干燥的接着皿上。在圆周上每等分之中部，按所标字样分别用干净毛细管小心点上谷氨酸、酪氨酸和混合氨基酸样品水溶液（图2-29（2））。点样时，毛细管中液体要尽量少些，与纸面接触的时间应尽量短些，勿使滤纸上所成圆点的直径超过5mm，每一支毛细管只能沾取一种溶液。用电吹风吹干，或在空气中自然凉干。
取一长2cm，宽1cm的同质料的滤纸条，将其一端剪成条状，卷起来即得纸芯（图2-29（3））。然后在圆滤纸的圆心处穿一小孔。孔之大小恰好使纸芯从滤纸无字的一面插入，
既不过松，又不过紧，然后剪去纸芯多余部分，使纸芯之上端尽量从纸面相齐。下端刚好接触皿底为宜。
取下滤纸，将展开溶剂10mL（皿中央溶液约2mm）经玻棒慢慢倒入培养皿中。切勿使溶剂沾到培养皿的边沿上面。再将滤纸放置如前。并迅速用同样大小之培养皿严密复盖于其上（图2-29（4））。当溶剂展开到接近培养皿边缘时，取出滤纸。拨去纸芯，迅速用铅笔划下溶剂“前沿”的位置。再用电吹风吹干或室温阴干。将培养皿中溶剂经漏斗倒回原瓶。为维护温度恒定在展开时不能在皿旁做加热操作。喷雾器装茚三酮溶液至半满。把茚三酮溶液均匀地喷到滤纸上，用电吹风烘干到显出各氨基酸的弧形色带（图2-29（5））。
量出每个斑点中心到原点中心的距离，计算每种氨基酸的Rf值。
（1） （2）点样
（3）纸芯的制作 （4）展开 （5）色谱
图2-29
四、 注意事项
1. 由于本法可检出以微克计的痕迹量的氨基酸，手指印含有一定量的氨基酸，可以被
检出，因此，不能用手直接触摸分析用的纸，要用摄子钳夹滤纸边。
2. 氨基酸与显色剂茚三酮溶液作用在一定的温度（约105℃）下才行，所以必须充分加
热烘干，显色才明显。
五、 问题
1. 什么是Rf值？为什么说Rf值是物质的特性常数？ 2. 哪些因素影响Rf的大小？ 3. 色谱法分离的原理是什么？
氨基酸的纸层析法分离
目的和要求
掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 原理
层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1903年俄国化学家茨维特(HBeT)发现用挥发油冲洗菊粉柱时，各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱，故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高度分辩力，从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。
根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类： 1.用固体吸附剂做支持物的称吸附层析；2.用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析；3.用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。
纸层析所依据的原理是分配层析，故属于分配层析的范畴。 一、分配层析
分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配情况不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内，再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱，同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相，把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体物质把它吸牢，这种固体物质本身对分离不起什么作用，对溶质也几乎没有吸附能力，称为支持物。进行分离时由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢，于是得到分离。分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相和流动相)间分配系数的不同，分配系数 (α) 的定义是：
α =溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)
滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素，纤维素的— OH基为亲水性基团，因此可吸附一层水或其它溶剂作为固定相。通常把有机溶剂作为流动相。当将溶质样品(被分离物)点在滤
纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂作为流动相自上而下移动，称为下行层析；反之，使有机溶剂自下而上移动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相对溶质进行连续的抽提，物质在两相间不断分配的结果即得到分离。滤纸层析原理还可进一步解释如下：可以把滤纸看成一个层析柱，又可把柱看成由许许多多连续的板层构成。如果有A、B两物质，A的分配系数 α=1，B的分配系数 α=1/3，又设固定相为S，流动相为M，两相互相接触而不相混溶，则当第一层流动相中加入单位量A、B两物质后，溶质根据一定分配系数在第一层的两相中分配(图10-1(1))。流动相继续向下层移动，固定相与新流下的流动相之间进行第二次分配，原来第一层流动相与第二层固定相间进行分配如此类推，经三次分配即可看出A、B最浓部分已经分开，A物质在第二层最浓，而B物质则在第三层最浓。如此继续抽提下去、再经若干次后，A和B两物质就可以完全分开。显然，A、B两物质分配系数相差越大，则越易分开。
物质分离后在图谱上的位置，可用比移值 Rf来表示，Rf值的定义是：从溶质层析的起点(原点)到层析斑点中心的垂直距离与从原点到溶剂流动的前沿的垂直距离的比值： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以 Rf值的主要决定因素是分配系数 ( α )。对于每一物质在一定条件下α值是固定的，因此Rf值为其特征常数，可做为定性鉴定的参考数值。
二、影响 Rf值的主要因素
1.物质结构对于Rf值的影响：“物以类聚”，极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。
2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地与溶质形成氢键。某些溶剂(例如酚，正丁醇等)是质子的供给体，而水既是质子的供给体又是质子的接受体。当溶质结构中增加能接受质子的基团(例如NH ２ )时，因酚与水都能给 NH ２基提供质子，所以酚和水两相对接受质子的基团的引力，基本上是一致的，因此当溶质结构中增加氨基时，该物质与酚和水的作用对其在酚和水两相间的分配影响不大，对Rf值影响较小。又例如当有机溶剂是质子的接受体(如三甲基吡啶，NH 3 等)，而溶质也是质子的接受体(如-NH ２基)，这时有机溶剂对-NH ２没有引力，而水却有引力，于是水的引力就大于有机溶剂，因此溶质就被水拉向水相，对Rf值的影响就大。
3.pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。在氨基酸的层析法中，改变溶剂的pH，使酸性和碱性氨基酸的Rf值变动较大，而中性氨基酸的Rf值变动较小。在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的极性降
低，从而使Rf值变大，而使碱性氨基酸的Rf变小。反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小，而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的Rf值变大。
4. 滤纸对Rf值的影响：滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。
5.温度对 Rf值的影响： Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf 值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以 Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±0.5℃。
无色物质的层析图谱可用光谱法 (如核苷酸类物质用紫外光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂有茚三酮、吲哚醌。本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH，时间影响较大。如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。样品中含大量盐时显色点上会出现白斑，空气中其它的杂质如氨，硫化氢或酚等皆会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定，用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，可以通过比色法定量测定氨基酸含量。由于纸上层析设备条件较简单，操作比较简便，并可以分离微量样品，因此纸层析方法已成为生化分析和研究的主要方法之一，广泛应用于氨基酸、肽、核苷酸，糖、维生素以及脂肪酸等的分离鉴定。 操作步骤
一、标准氨基酸纸上层析 1.单向上行层析 (1)氨基酸 Rf值的测定
滤纸：选用国产新华 1号滤纸(若有较多的样品需在纸上分离，可采用新华3号滤纸)，戴上橡皮手套，将滤纸裁剪成28cm×28cm，在距纸边2cm处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔3cm处画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过0.5cm。
点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，氨基酸的点样量以每种氨基酸含 5～20μg为宜，将准备好的滤纸悬挂在点样架上，滤纸垂直桌面，用点样管(也可用血色素管代替)吸取氨基酸样品10μg(1μg/μL)，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用一加热装置(如吹风机或灯泡)，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，特别是谷氨酰胺破坏，影响定量结果。