将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。
本实验做两张单向层析谱，每张点 6种氨基酸。一张测定酸系统中的Rf，一张测定碱系统中的Rf。
展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，周围放三个小烧杯，内盛平衡用的溶剂。盖好钟罩，平衡1～2h(每个钟罩内可放三个培养皿)。平衡后，打开钟罩上塞子，用长颈漏斗。插入罩内，使管下口碰皿底，沿管加入展层溶剂，然后迅速取出漏斗(注意勿使它碰纸)。当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置，挂在绳上或点样架上晾干，使纸上溶剂自然挥发，直至除净溶剂。
酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，平衡溶剂与展层溶剂相同。温度25℃，时间10～20h。
碱溶剂系统：正丁醇：12%氨水：95%乙醇=13:3:2(体积比)，平衡溶剂为12%氨水，温度25℃，时间14～16h。
注意，使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。平衡溶剂每烧杯放 10mL左右，展层溶剂每张约需25mL。
显色：将已除尽溶剂的层析滤纸平夹在层析架上，将架与地面略平行，用喷雾器将 0.5%茚三酮无水丙酮溶液均匀地喷在纸上。试剂内不可含水，否则会把样品冲散以致图谱模糊，每张纸共用显色剂25mL，分别在两面喷雾，滤纸充分晾干后，置65℃鼓风箱中30min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色班点。 Rf 值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。或用一特制的橡皮尺直接读出Rf 值。尺的制作方法如下：
取细乳胶管一段，画上刻度，每大格为1cm，每小格为1mm(图10-4)。测量时将原点与刻度“0”比齐，再拉长橡皮小尺，使溶剂前沿与“10”比齐，读出斑点中心所在的刻度即得Rf值。 计算出 6种氨基酸在酸、碱系统中的Rf值。
(2)氨基酸标准曲线的制作 滤纸：规格、尺寸与前同。
点样：配制一个浓度为 8mmol/L分子的天冬氨酸溶液，在纸上点上不同的量：5、10、15、20μl，留一空白点作对照。点样操作与前同。
展层：展层采取酸性溶剂系统，即正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2,展层条件与操作见前。
显色：除尽溶剂的层析纸用 20mL茚三酮丙酮溶液在纸的一面均匀喷雾，自然干燥后，置于65℃烘箱内，准确地烘30min，取出。
定量测定：剪下层析谱上天冬氨酸斑点，其面积大小相仿，再剪一块空白纸作比色对照。把剪下的纸片再剪成梳状细条，分别装入干燥试管内，加入 5mL0 1%硫酸铜(CuSO 4 ·5H 2 O)：75%乙醇=2：38的溶液洗脱，间歇摇匀，洗脱液呈粉红色，待15min后用520mm处测定O D值。以氨基酸含量(μg数)为横坐标，光吸收值为纵坐标作图，其结果应为直线关系，但不同氨基酸其斜率不同。 2.双向上行纸层析
点样：样品为混合标准氨基酸，点样量 15或20μl。 展层：双向展层。
第一向为碱系统正丁醇： 12%氨水：95%乙醇=13:3:3(体积比) 第二向为酸系统正丁醇： 80%甲酸：水=13:3:2(体积比)
第一向展层一次，必要时亦可展层两次，第二向一般展层一次即可。二向的展层条件分别与酸、碱单向展层的条件相同。进行双向层析时，先用第一向溶剂展层后，使干燥，将纸调转 90°，再用第二向溶剂展层。
显色：显色剂采用 0.5%茚三酮溶液。显色条件与标准曲线制作显色部分相同。
定性鉴定与定量测定：双向层析Rf值由两个数值组成，即在第一向计量一次(碱系统)和在第二向计量一次(酸系统)，分别与已知氨基酸在酸、碱系统的Rf值对比，即可初步肯定它为何种氨基酸。找出谷氨酸斑点，将它剪下，在同一张纸上再剪下一块大小相仿的空白纸作对照，如前所述，用硫酸铜乙醇溶液洗脱并进行比色测定，所得比色读数在标准曲线上查出谷氨酸含量，计算出样品中谷氨酸的毫克分子数是多少? 二、样品中氨基酸的分析 (以鸡蛋蛋清为例)
1.水解液的制备：取鸡蛋清1滴(约0 2mL)，加到2mL的安瓿中，再加入2mL经过重蒸的盐酸溶液(5~7mol/L)，封口后置于110℃烤箱中进行封管酸水解。24h后打破安瓿。将酸水解液转移到小烧杯中，于沸水浴上蒸去盐酸，内容物蒸干时可加少量蒸馏水，再次蒸发，重复3～4次。最后加1mL蒸馏水。 2.单向上行纸层析分析
点样：在滤纸上 (规格尺寸同图10-5)。点上不同体积：10、20、25、30μl的蛋清酸水解液，同时再点上一个标准氨基酸混合液点(15μl/点)。操作同前
展层：条件同前。采取正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2系统，操作同前。
显色： 0.1%茚三酮丙酮显色，操作同前。
层析谱：鸡蛋清水解液展层后一般可以分出 10～13个氨基酸斑点。找出那一种点样量的层析效果最好，并用六种标准氨基酸混合液的层析斑点及文献资料上关于鸡蛋清蛋白水解液的成分作比较。
3.此实验中应注意的几个问题
(1)使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。 (2)取一支破损的0.1mL吸量管，将下端拉成毛细管，然后在碎磁片边缘上磨尖。注意，在点样时应尽量使用上端的刻度，因为靠近尖端的刻度已不准确。
(3)层析纸经第一向层析后，上端未经溶剂走过的滤纸(距纸边约1cm)与已被溶剂走过的部分形成一个分界线，进行第二向层析前，需将第一向上端截去约2cm除去边缘，在截去边缘以前，先将原点到溶剂前沿的距离量好，记下来。
(4)为了鉴定未知样品中某几种氨基酸的存在，仅用一种溶剂系统展层是不够的。一船应采用2～3种溶剂系统展层显色后，再分别与该种溶剂系统的标准氨基酸图谱比较，相互印证，才能作出比较确切的结论。
试剂和器材 一、试剂
1.氨基酸标准液(1mg/mL)：六种氨基酸是天门冬氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、亮氨酸、分别配制成上述浓度的溶液。
2.8mmol/L天门冬氨酸溶液。 3.95%乙醇。
4.80%甲醇(稀释前需测比重)。 5.12%氨水(稀释前需测比重)。 6.0.1%茚三酮丙酮溶液。 7.0.5%茚三酮丙酮溶液。
8.氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)。 9.正丁醇(需重蒸，沸程：116～120℃)。
10.0.1%硫酸铜(CuSO 4 ·5H 2 O)：75%乙醇=2：38溶液。硫酸铜难溶于乙醇，不能用乙醇直接配制。将硫酸铜溶液和乙醇混合后放置过久亦会产生沉淀，因此必须在临用前按比例混合。
11.5.7mol/L重蒸盐酸溶液：将商售化学纯盐酸用磨口蒸馏器蒸馏，收集恒沸点部分，即为5.7mol/L盐酸溶液。 12.鸡蛋蛋清。 二、器材 1.新华滤纸。
2.培养皿(直径115mm)。 3.电热鼓风干燥箱。 4.恒温水浴和沸水浴。 5.72型分光光度计。 6.离心机(4 500r/min)。 7.研钵。
8.喷雾器及吹风机。 9.点样管及点样架。 10.针、线、尺。 11.橡皮手套。 12.安培瓶(2mL) 13.烧杯(50mL)。
14.钟罩(高约430mm,直径约290mm，具磨口塞)。 思考题
1.什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统? 2.性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?
3.酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影响? 4. 滤纸上点上 1 μL l0.02mol/L 的甘氨酸 ( 分子量 =75) 溶液，请问实际上点了多少微克的氨基酸 ?