5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。 五、实验作业 将实验结果填入下表中：
计数次数 每个大方格菌数 1 第一次 第二次
二、微生物细胞大小的测定
（一）实验目的了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。 （二）实验原理
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图20-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，
2 3 4 5 稀 释 倍 数 试管斜面中的平均值 总菌数 图 20-1目镜测微尺
由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
（三）、实验器材
1．活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌种、枯草杆菌(Baccillus subtilis)染色标本片。 2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸。 （四）、实验方法
1．目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图20-3)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm
用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 2．细胞大小的测定
(1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2） (2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
(3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。 （4）同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。 （五）、实验作业： 将实验结果填入下列表格 表20-1 目镜测微目尺校正结果
物镜 目尺格数 台尺格数 目尺校正值（μm） 10× 40× 100× 表20-2 酵母菌大小测定记录 （格） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值 长 宽 表20-3 枯草杆菌大小测定记录 （格） 细胞数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值 长 宽 结果计算 长μm＝平均格数×校正值 宽μm＝平均格数×校正值 大小表示：宽μm×长μm 六、实验总结
实验九 土壤中微生物分离纯化培养
一、实验目的
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。
二、实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法 稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。
三、试剂与器材
1.器材 盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基
四、实验内容 1.土壤稀释液的制备
2.微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术
五、关键步骤及注意事项
1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。
2.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。
六、思考题
1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。 2.如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜?并说明理由。
实验十 淀粉酶产生菌的筛选
一、实验目的
1）设计淀粉酶产生菌检出方案。 2）学习淀粉酶产生菌的筛选方法。 二、实验用品
菌种：
黑曲霉（Pr3）；枯草杆菌(7658)； 卡尔丝酵母(2604) 其它：
察氏培养基；无菌培养皿；碘液 三、实验原理
淀粉酶产生菌向胞外产生淀粉酶，使淀粉分解成麦芽糖。 利用淀粉遇碘变蓝的特性进行检测 四、实验方法
? 1）配制察氏培养基 ? 2）制作平板
? 3）在三个不同区域接入三种菌，进行培养 ? 4）菌长好后，加入碘液，进行观察 五、实验结果 菌种 黑曲霉 （Pr3） 透明圈 （有无、大小） ??㏒???琰 ??㏒???琰茞 ??㏒???琰茞茞??ü ??ü ??ü 枯草杆菌(7658) 卡尔丝酵母(2604) 六、思考题
1.说明透明圈产生的原因。 2.如何判断产淀粉能力的强弱？