药品蛋白的稳定性：升级版
摘要：1989年，Manning, Patel, 和 Borchardt写了一篇关于蛋白稳定性的文章，这个文章大量的参考了以前的工作。当时,重组蛋白治疗还处于初级阶段。这篇综述总结了关于蛋白稳定性和剂型的进步。另外讨论了当前已知的蛋白质化学和物理的不稳定性，部分章节还包括蛋白在水溶液和干粉状态下化学和物理的不稳定性。使用化学改造和诱变提高稳定性及化学和物理的相互作用的不稳定性。
介绍：1989年，Manning, Patel 和 Borchardt写了一篇综述总结了那时已知的蛋白药品的稳定性和稳定，这篇文章被引用了500次，二十世纪八十年代晚期，在美国市场仅有三种重组蛋白产品：Orthoclone (OKT-3), 人胰岛素和 tissue plasminogen activator.。如果一个包含血浆来源的产品，获准的生产的蛋白仅有十二个。显然的，重组DNA技术已经极大地改变了药品市场。现在仅仅在美国市场以有近20种抗体产品和几乎150种以蛋白为基础的产品被普遍应用。另外的，我们所知的关于蛋白稳定性和剂型已经急剧的增加。本篇综述的目的是阐述过去20年中我们所了解的蛋白稳定性的进步。除了更新原有的评论文章的部分，在1989年的文献中没有被讨论的主题在这篇文章中被讨论，例如发生在生物过程中的蛋白质化学和物理的不稳定性的相互关系，生物加工过程中冻干周期对蛋白质的稳定性影响，以及在维持蛋白质稳定性的过程中包装的重要性。
我们把蛋白不稳定分为两种：化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性涉及共价键的合成和断裂的过程，生成新的化学实体。表一中列出一个较为常见的化学降解过程。相反，蛋白质的物理不稳定性其化学成分并没有改变，而是蛋白质物理状态的改变。这包括变性，聚集，沉淀，吸附（见表1）。沉淀被用在这里是指不溶性而不是不溶性聚集体形成。
我们关于所有蛋白降解途径的知识有很大提高比20年前。因此，这篇文章的重点是自从1989年以来取得的进步。另外还有降解过程，及讨论不够详细的主题。这些已列入作为如下独立的章节。举例来说，已经有许多关于各种辅料增加蛋白质构象稳定性许多文章，无论是在水溶液和干燥状态下。此外，简要概述了蛋白质稳定性的方法，包括各种干燥法，化学改性，并定点突变。最后，以化学和物理之间的相互关系提供了不稳定。
化学不稳定性 去酰胺
20年前，
已经了解去酰胺化，它包括天冬酰胺和谷氨酰胺侧链酰胺的水解，这是蛋白及肽普遍的降解途径。它仍被视为是肽和蛋白质最常见的化学降解途径。从监管的角度来看，去酰胺化的发生于杂质的生成和产物降解有关。另外，其可以增加免疫原性。 在原来那篇综述文章的时候，药物相关蛋白去酰胺化的例子很少，其中包括人生长激素（hGH），胰岛素，γ-球蛋白，血红蛋
白。此外，外在因素如pH，温度，离子强度的影响也已经被知道。自那时以来，现在可用的关于去酰胺化及相关反应的信息大幅增加，可以在一些杰出的综述文章及相关书籍中找到。可以在www.deamidation.org 上找到相关主题。
天冬酰胺的去酰胺化
天冬酰胺去酰胺化的过程是指在酸性条件下天冬酰胺侧链氨基直接水解形成天冬氨酸。在这种情况下，去酰胺是受酸的催化作用。同样，谷氨酰胺残基转化为谷氨酸（正如在下面将详细描述）。但是，这个机制是很少看到，由于pH值必须小于3。 在中性至碱性溶液（即大于pH6），该机制的变化到一个分子环化反应。第一个步骤是天冬酰胺相邻的氨基酸残基的羰基N+1发动对天冬酰胺侧链的亲核攻击。（如图1）这一步是碱催化，因为骨架上酰胺质子结构的抽象或部分抽象使的氮更加亲核，加速了反应。一个环化的酰亚胺（也称为丁二酰亚胺或Asu）是由氨的损失所形成的中间体（图1）。由于氨是一种气体，通常在溶液中不保留，这一步是不可逆转的。虽然Asu中间体往往能够作为降解产物被检测到，它很容易水解，在水溶液中形成ASP和isoAsp产物（图1）。在Asu五元环中间体的形成被认为是天冬酰胺去酰胺真正的原因这比谷氨酰胺去酰胺化更流行，因为五元杂环比与谷氨酰胺去酰胺产生的六元环更稳定。 因此，在原天冬酰胺残基位点，去酰胺生成两个降解产物（ASP和isoAsp）。随着消旋
的可能性，可能有四种产物形成（L-Asp, D-Asp, L-isoAsp及 D-isoAsp）。现在已经知道，消旋不会明显的发生在任何Asu中间体，正如先前认为的。相反，它似乎是一个平行的降解途径。Dehart 和 Anderson已经详细的对分子环化的动力进行了描述。通过环化分子对消旋缺乏的观察，已经产生较大的蛋白。
天冬酰胺去酰胺化对蛋白序列的影响
有些关于去酰胺对主要序列影响的工作，1989年已经做了，特别是认识到天冬酰胺-甘氨酸结构是特别容易去酰胺。随后，Robinson 及其同事对去酰胺化对序列的影响做了细致的研究。最终，他们的实验结果形成了有效的预期计划。在一般情况下，两种趋势是显而易见的。
首先，因为天冬酰胺残基发生更快的去酰胺后氨基酸具有更小的侧链，大概是由于最初的环化反应的空间位阻的不足。二，随后有侧链氨基酸，可作为捐赠者往往作为氢键，以加快反应，可能是由于分子内氢键结合天冬酰胺的羰基氧，使之更加亲电，从而有更多反应亲核攻击。
因此，不需要关注每一个天冬酰胺残基的去酰胺化。对于制药科学来讲，只有那些后面连着小的或氢键给予残基（例如，丝氨酸，天冬酰胺，或ASP）的天冬酰胺才会在一定时间范围内表现出脱酰胺化。例如，Chelius等发现在单克隆抗体中的天冬酰胺脱酰胺化发生在天冬酰胺—甘氨酸和天冬酰胺—天冬酰胺序列中，而Xiao和
Bondarenko发现脱酰胺化发生在天冬酰胺—天冬氨酸序列中。总体而言，天冬酰胺—甘氨酸是最活跃的序列，符合Robinson 和 Robinson的图表（表II）
。通常，前面的残基很少或不会对脱酰胺化的机率产生影响，至少在溶液中是这样的。Li等人发现蛋白在固体状态下谷氨酰胺或谷氨酸在该位置会表现出加速脱酰胺化反应，大概是通过增加周围的天冬酰胺残基的水合起作用。
在酸性pH值时，对于脱酰胺机制不涉及环酰亚胺的形成。相反，经过质子化了的酰胺侧链直接被水亲核攻击。因此，在酸性条件下氨基酸序列就不是影响脱酰胺化的主要因素。
高级结构对天冬酰胺脱酰胺的影响
1989年，
高级结构对脱酰胺效率影响的能力才刚刚开始受到关注。1988年，Kossiakoff证明，肽链的灵活性会影响去酰胺率。其他研究组通过对一种给定的球蛋白结构中分散的天冬酰胺的脱酰胺化率进行检测，也得到了相同的结论。此外多项研究表明，在一些二级结构中的天冬酰胺表现出缓慢的脱酰胺化率。这些二级结构有α-螺旋（33,34），β-折叠（35）和β-转角（36,37）。
一个在序列中的天冬酰胺所处的三维结构信息可以增进对其脱酰胺率预测的准确性。此外，三维结构的改变会影响去酰胺率。例如：在胰岛素α-螺旋结构中的AsnB3表现出缓慢的脱酰胺化。
单克隆抗体中的脱酰胺化
我们关于单克隆抗体的稳定和结构方面的知识，在过去的20年里呈指数增长。这包括那些重要的分子药学的脱胺基化研究。在一般情况下，单克隆抗体的脱酰胺化是可见的异质性、化学不稳定和其他种类的糖基化的差异有关。1992年，Kroon等人报告了，第一个上市单克隆抗体产品OKT- 3发生脱酰胺化。随后的十年里出现了零星的单克隆抗体脱酰胺的报告。在过去的5年中，在单克隆抗体脱酰胺得报道数量已大大增加。一些报道关注外在因素的影响，一些报道的重点是序列的影响，而另一些重点放在利用某些类型的质谱分析方法，监测和量化脱酰胺化。这些研究为监测和量化任何蛋白质或肽的脱酰胺化提供了坚实基础。另一些研究组报告说，使用的电荷分离方法来检测和量化肽和蛋白质的脱酰胺化，而另一些研究组用反向高效液相色谱法，肽图谱和拉曼光谱去检测脱酰胺化。不过，后者非常不敏感，需要脱酰胺化超过10％。
长期储存的人类单克隆抗体导致脱酰胺在天冬酰胺和谷氨酰胺残基处，还包括其他化学不稳定性，例如碎片和pGlu形成。那些其他的降解途径在下文中进行讨论。这似乎是真实的是，在较小的肽和蛋白质中控制去酰胺率的因素（主要序列，温度，pH值等），同样在单克隆抗体降解是重要。
其它药用蛋白的脱酰胺化
除了单克隆抗体脱酰胺化的大量工作，其他一些研究也描述了相关肽和蛋白药品，包括疫苗和抗原蛋白的脱酰胺化。
这些研究见表三。在一般情况下，任何蛋白质或肽包含ASN -XAA序列，随着时间的推移就容易脱酰胺。
脱酰胺化速率的控制
一些减慢脱酰胺化的方法已经被制定了。最主要的方法是控制pH。天冬酰胺的脱酰胺化速率曲线呈现v字型，当pH在3~6时速率最小。此外，作为一种化学反应，它显示典型的阿伦尼乌斯规律。实验的蛋白或肽在实验温度范围下不改变其结构。
有趣的是，
通过改变蛋白的结构可以减慢脱酰胺化。在1989年，Φ/Ψ角度就被认为是发生分子内亲核攻击，进而形成Asu中间体的条件。Φ和Ψ分别是指为中Cα–N键和C(O)-Cα的旋转角。因此，限制了肽链的折叠，并减慢了脱酰胺化。这是减慢脱酰胺率明确和无可争辩的高层次结构的基础（见上文）。这是通过排除溶质可以改变的多肽链的折叠性。增加蔗糖可以使肽形成β-转角构象，从而减缓脱酰胺化。糖和多元醇压缩乙醇脱氢酶的结构，从而减慢脱酰胺化。同样，如果去除包含组氨酸的蛋白的C端氨基酸，将导致脱酰胺化。这也许是因为影响了蛋白的高级结构造成的。
最后，我们可以想像，采用较低pH酸度配方脱酰胺率将放缓。虽然这些相同的溶液，还可以影响结构，粘度和溶剂介质，所以这种影响可能并不完全是由于酸碱性造成，所以非水溶剂已经被采用。模型肽的粘度的影响已被描述。同样，电介质和粘度对单克隆抗体Asp异构化的影响已经测定。在
这种情况下，提高化学稳定性是以降低稳定的构象为代价的。因此，使用非水溶剂，对于多球蛋白这种办法可能不是可行的，但对于肽是可行的，在溶液中肽的构象并不重要，重要的是保持生物活性。
1989年之前，据了解，的已经知道某些缓冲液表现出一定减缓催化天冬酰胺脱酰胺的作用。大部分缓冲液已经被证明出现一定缓冲能力程度。因此，限制缓冲液的量可以减缓脱酰胺速率。在过去的20年中，这个问题较少的被研究了。Tyler-Cross和Schirch研究表明，模型肽脱酰胺一般是碱催化，但他们并没有对特定碱性催化剂进行研究。所以，除了一些关于缓冲作用的观察，脱酰胺催化机理方面的研究很少。至于最近对缓冲作用的观察，Girardet等人报道说pH=7.4时α-乳清蛋白在磷酸盐缓冲液下的脱酰胺速率要高于在Tris缓冲液中的速率。Zheng和Janis进行了单克隆抗体脱酰胺缓冲液影响的详细研究，测试了酒石酸，柠檬酸，琥珀酸，磷酸盐。他们发现，柠檬酸是最好的选择，而pH值必须小于5。
固态下的脱酰胺化
Lai 和 Topp已经综述了在固体状态下肽和蛋白质化学降解的倾向。概括而言，这里描述的许多反应，包括固态多肽脱酰胺化已经被观察到。例如，固态下环形和线性肽的脱酰胺化速率被分析。和在液态下相比，在固体状态下脱酰胺速率也可以被发现。最后Houchin 和 Topp最近报道了肽和蛋白质的化学降解，包括微球包裹中的脱酰胺化。
谷氨酰胺的脱酰胺化
在过去20年中，我们关于谷氨酰胺脱酰胺化的了解得到了惊人的提高。谷氨酰胺的脱酰胺化不像天冬酰胺脱酰胺那么普遍。天冬酰胺残基环化形成一个五元环。对于谷氨酰胺，中间体是一个六元环，它没有像五元环那么良好的热力学基础。当然，谷氨酰胺脱酰胺化是在1989年才被发现。因此，因为很少有报道，所以在我们之前的综述中并没有讨论。直到目前，Joshi 和Kirsch已经报道了关于在肽中的谷氨酰胺脱酰胺化的详细机制研究。在大蛋白中的谷氨酰胺脱酰胺化也已经有了一些报道，如在晶体蛋白和单克隆抗体中。
脱酰胺化的理论研究
除了对肽和蛋白脱酰胺化的大量研究外，一些脱酰胺化理论研究也已经开展。这些包括分子动力学（MD）模拟和从头计算。值得注意的是，Radkiewicz等。 2001年发现的骨架的构象（例如Φ/Ψ角度）影响NH集团的酸度。甘氨酸能够提供更多的构象空间，显示增加NH酸度，这将有助于提高酰胺去酰胺率。因此，天冬酰胺—甘氨酸序列提高反应速率，可能并不完全由于空间位阻不足导致分子内的亲核攻击。
琥珀酰亚胺的形成
在一般情况下，脱去酰胺基的形式（Asp和isoAsp），以及相应的环化酰亚胺（Asu）中间体，已分离和鉴定，尤其是在肽中。单克隆抗体的环化酰亚胺中间体已多次分离
和描述。来至Amgen的研究组采用的疏水作用层析（HIC），阳离子交换色谱（CEX）和液相色谱-质谱（LC- MS）。来鉴别贮存在高温下的单克隆抗体，尤其是IgG2s中Asu的形成。主要降解产物似乎是环化酰亚胺（Asu）位置在轻链（LC）的30位置。 其他研究也报道发现Asu的形成是在具有102个残基的重链的LC32位置。
琥珀酰亚胺形成，在其他系统已经被报道。例如，人生长激素的受胁迫样品中在Asp–Gly位点形成琥珀酰亚胺产物，它已经被用反相高效液相分离和定量。类似的降解胶质细胞源神经营养因子中也有报道，其琥珀酰亚胺产物形成在96位置。
退化形式的蛋白的结构和药代动力学与活性天然蛋白质是相同。溶菌酶也有在Asp–Gly位点形成琥珀酰亚胺产物的报道。
天冬氨酸的异构化
一旦环化亚胺的中间形式，它可以打开或天门冬氨酸或异天冬氨酸产品的形成（图1）。这种机制表明，天冬氨酸本身可以环化形成琥珀酰亚胺（Asu），从而使天冬氨酸向异天冬氨酸转化。这个反应被称作天冬氨酸—异天冬氨酸互变，但是通常情况下是天冬氨酸向异天冬氨酸转化。对于脱酰胺化和天冬氨酸异构化的限速步骤是相同的，其速度就是被环化亚胺中间体的形成所控制。因此，同样的方法可采取去减缓每个反应。换句话说，通过pH达到对缓慢脱离子化的最大控制。脱离子化可导致环化。 早期在这方面的研究指出天