海南师范大学
从环境中分离放线菌 实验设计方案
专业：生物科学 班级：2010级一班 组长：陈丽娟
组员：李万蕊、曹露露、朱嘉宁 时间：2012年5月24日
一、实验目的
1、学习从土壤中分离放线菌的方法。
2、练习、掌握微生物接种、移植和培养的基本技术。掌握无菌操作技术。 3、掌握无菌操作技术。 二、实验原理
放线菌是原核生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多[1]。
土壤颗粒的分散程度对于分离放线菌也有影响。钱恒段等[2]报道，用胆酸钠处理土壤悬液后土壤分散效果较好，且优于纯蒸馏水。这可能是因为胆酸钠对土壤腐殖质具有较强的结合能力从而有利于破坏土壤团聚结构。
据杨宇容等[3]报道,重铬酸钾对土壤真菌、细菌的抑制作用较明显，然而对放线菌并无抑制作用。而且其价格低廉，如安德荣等[4]报道其可作为理想的放线菌分离抑制剂。徐成勇等[5]实验证明酵母膏、SDS（十二烷基硫酸钠）也有抑菌的作用。
本实验所用方法为综合徐成勇等[5]及钱恒段等[2]实验结果所得。 三、实验材料 1、样品
干燥的营养基质丰富的苗圃土 2、仪器
铲子、牛皮纸、搪瓷杯、锥形瓶、玻璃棒、烧杯、小试剂瓶、标签纸、移液管、接种环、试管、记号笔、酒精灯、电子天平、电炉、恒温培养箱、加压蒸汽灭菌锅、电热干燥烘箱 3、培养基及试剂配制
（1）培养基（高氏一号琼脂+重酪酸钾培养基)配制:
配方：可溶性淀粉20g、K2HPO4 0.5g、1mol/LNaOH、MgSO4?7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4?7H2O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、250mg重酪酸钾、PH7.2~7.4。
步骤：用搪瓷杯先量取500ml自来水在电炉上加热。根据配方，依次称取各种药品加入搪瓷杯中，搅拌均匀。可溶性淀粉称入烧杯中，加入50ml自来水调成糊状，待培养液煮沸时加入淀粉糊，边加边搅拌，防止糊底。之
后，加入琼脂煮沸至完全溶化，补足1000ml水量。接着，缓慢加入NaOH液，边加入边搅匀培养液，然后用PH试纸测其酸碱值，调PH至7.2~7.4。 趁热分装于8个三角瓶中，塞好棉塞。用牛皮纸包扎好，贴好标签。最后，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min.
（2）试剂配制：
1mol/LNaOH、6%酵母膏和用5 mmol / L 磷酸缓冲液稀释的0.05% SDS 四、实验方案 1、土样的采集及处理
（1）方法：在苗圃，按对角交叉（五点法）取样。先出去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2~10cm处的土壤于叠好的牛皮纸袋里。将土样放入三角瓶中，加入少量胆酸钠，再加适量蒸馏水振荡溶解制成土壤悬浮液。调节稀释液的PH为7，略微加热后冷却至40℃。之后，再加6%酵母膏和用5 mmol / L 磷酸缓冲液稀释的0.05% SDS震荡20min。
（2）原理：放线菌在较干燥的，营养基质较丰富的中性或微碱性土壤中分布较多；胆酸钠有利于分散土壤颗粒；一定浓度的酵母膏和SDS有抑制细菌、真菌的作用。
（3）注意：所取的土样不可过湿，防止样品中杂菌过多；至土壤稀释液时要振荡充分，是土样与水充分混合，将菌分散。 2、器材灭菌
蒸汽灭菌制备无菌水。
干热灭菌9个锥形瓶、平皿10个、玻璃棒3个、移液管3个、10个试管 3、分离
（1）方法：将处理后的土壤悬浮液稀释100倍备用。加热已制备并灭菌好的高氏合成1号琼脂+重酪酸钾培养基，在无菌条件下倒10个平板然后，贴好标签，冷却。用平板稀释法[6]（稀释度从10-3到10-5,浓度设置见）将菌种接种在高氏合成1号琼脂+重酪酸钾的平板培养基上,28℃培养5~7d。
（2）原理：见上文实验原理。
（3）注意：稀释样品时要在无菌条件下进行；每个稀释度做2~3个培养皿，并做好标记；实验中要留一个空白对照；注意划线时的操作。
1
4、纯化
（1）方法：5~7天后，加热培养基，倒斜面。选择挑取效果较好的菌落用接种环接种于高氏1号斜面，28℃培养5~7d。
（2）原理：放线菌的群体特征[7]：小型、干燥、不透明、与培养基连接紧密，难以挑取，表面呈致密的丝绒状，上有一薄层彩色“干粉”，正反面颜色不一致，边缘琼脂平面有变形。
（3）注意：实验过程要做好标记。 五、实验预期结果
由于时间有限，不能对土样进行风干，可能会影响分离得到的放线菌的纯度。 而且可能实验进行不到纯化这一步，仅停留在分离就必须终止实验。但是由于预先对土样进行的充分的处理，培养时也选用了针对放线菌的培养基并且加入了有效的抑制剂，即使没有纯化，分离后也可达到实验目的。
参考文献
[1] 赵斌,何绍江,等.微生物学实验[M].北京:科学技术出版社,2002.
[2] 钱恒段,淑蓉.放线菌选择性分离方法综述[ J ].安徽农学通报,Anhui Agri.Sci.Bull.2011,17（15):60~61.
[3] 杨宇容,徐丽华,李启任等.放线菌分离方法的研究[ J ].微生物学通报,1995,22(2):88~91. [4] 安德荣,慕小倩,刘翠娟,赵文军,等.土壤拮抗放线菌的分离和筛选[ J ].微生物学杂志,2002,22(5):1~3.
[5] 徐成勇,袁野,黎丹辉,夏欢耕,诸葛健.选择性分离放线菌[ J ].无锡轻工大学学报,1999,18(2):45~49.
[6] 孙勇民,任超,范延辉.应用微生物学[M].北京：北京师范大学出版社,2007. [7] 周德庆。微生物学教程第3版[M].北京:高等教育出版社,2011.4.
2