内可读出350bp，DNA序列分析效率可达到6000bp／h。1994年，日本科学家提出的另一种测序装置，20只毛细管并列电泳，采用激光荧光电荷耦合阵列检测器(ccD)检测，有较高的灵敏度。采用ccD检测器，100只毛细管阵列电泳装置，可同时检测100只毛细管的DNA分离样品。
使用超薄层凝胶板电泳进行测序，凝胶板厚度仅为50～100斗m，配备流水冷却装置，场强提高到250V／cm，大幅度地提高了电泳速率。而一般的电泳胶厚度为200～400肛m，电场强度较低(75v／cm)，限制了测序的速度。在此基础上如采用激光荧光ccD检测器检测，则可比常规电泳测序速度提高9倍，达到8000bp／h以上。
②不用电泳分离的测序新方法
DNA测序方法研究的一个热点是不用电泳分离的技术。这一类尝试主要包括： ⑧杂交法(sequencing by hybridization，SBH)，这是有希望用于快速DNA测序分析的一种新技术。它应用一套已知序列的寡核苷酸探针，与待测DNA样品进行杂交，寻找靶DNA链上的互补序列，形成完全互补的双链，根据杂交情况排列出样品的序列信息。目前SBH技术用于同源序列的比较测定、点突变的检测已日趋成熟。SBH作为一种快速、自动化的测序方法，相信未来几年中会有迅速发展，在今后的大规模测序以及分子生物学和基因诊断中发挥重要的作用。
⑥质谱法中发展较快的是基体协助激光解析离子化(MALDI)一时问飞行质谱法用来检测双脱氧循环产生的DNA片段的序列，相关的延迟离子抽提技术(delayed ion exlraclion，DE—MALDI)，可提高MALDl分析精度，还有MALDI一’FOF’DNA测序方法。这一类技术提供了一种新的非凝胶碱基DNA测序方法，最终有可能比传统的方法学更加快速，并为将来的大规模质谱DNA测序提供了可能。
⑥原子探针显微镜、扫描隧道显微镜(sTM)和原子力显微镜(AFM)新技术的发展，使快速、高分辨直接观测DNA分子构象成为可能。流动式单分子荧光检测法也在发展中。
3．荧光原位杂交
原位杂交(ISI{，in situ hybr·idization)，是一种在保持组织、细胞或染色体原有形态结构的基础上，对其内部特殊核苷酸顺序进行检测及定位的分子生物学手段，可用于染色体畸变分析。其原理是将已标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中的DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的：用放射性同位素标记探针和放射自显影曾一度作为惟一、高度敏感的IsH手段。近年来，利用化学修饰合成核苷酸(如dig—uTP，duTP及ddUTF。等)，并将这些核苷酸掺入可与被检目标序列杂交的RNA、DNA或寡核苷酸片段中，杂交后通过荧光法、酶沉淀法或发色团检测来鉴定目标序列是否存在及其位置。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FIsH)是目前最常用的ISH手段之一。
(1)荧光原位杂交的原理和特点
荧光原位杂交的基本原理为：只要两个核酸分子的碱基序列互补，就可在适宜条件下形成稳定的杂交分子。FISH就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体DNA进行杂交，在下改变其结构和分布格局的情况下进行细胞内DNA、RNA某特定序列的测定。FISI-I可用于染色体精细结构分析，非整倍体检测，中期、间期细胞染色体数目分析，微核来源鉴定及精子非整倍唪检测。荧光原位杂交技术具有操作及观察分析简便、立体分辨率高、信号明亮清晰以及安全风险性小等优点。此外，利用不同荧光物质所修饰的核苷酸标记不同探针，可在同一样品中同时识别和分析多个目标顺序。特别是20世纪90年代发展起来的多色FISH计术，在同一细胞核或中期染色体中显示出不同的颜色，从而可同时检测2种以上DNA的二维结构，制备出染色体的光谱核型，使全染色体的自动化分析得以实现，大大拓宽了F[SH的应用范围。而20世纪90年代出现的DNA fibre。一FISH，除显著
提高了FISH的空间分辨率外，也使FlsH灵敏度进一步提高。
(2)荧光原位杂交技术一般程序
一般包括探针制备、组织或细胞的处理、杂交以及信号的显示与分析。其流程如下：
DNA探针标记(利用化学修饰合成的核苷酸进行缺口平移、随机引物或PcR扩增标记) 已经固定的组织、细胞或染色体与探针的变性处理D 37qC湿盒内杂交2～72h
荧光显微镜下直接检测杂交信号(探针上的信号分子可被激发荧光) 以荧光标记抗体与探针信号分子结合D荧光显微镜下观察杂交信号 具体操作步骤包括： ①制备和标记探针
在遗传毒理学研究中一般用DNA探针。目前识别畸变的FIsH探针大致可分为染色体序列探针、由许多DNA大片段组成的全染色体探针和着丝点探针。现在主要通过质粒重组、PcR扩增和人工合成等3种途径制备探针。常用的探针信号标记方法有2种：①直接标记法。将荧光分子直接标记于探针DNA／RNA上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测，这种方式快速简捷，背景干扰很少，但杂交信号较弱，且不能进一步放大，目前已较少采用；②间接标记法。采用一个中间分子标记探针，杂交后再用生物素或地高辛等荧光分子标记的中间分子的亲和物或抗体进行检测。
②染色体原位杂交
杂交前变性处理染色体标本，使染色体DNA变为部分单链，并去掉附着的RNA及蛋白质，变性处理生物素或地高辛修饰的探针。变性常用加热或碱变性，变性的温度和时间随探针和组织类型的不同而变化，目的是为了保存组织的完整性和最大的杂交效率。变性后的探针与变性后的染色体单链DNA在适合的温度、盐浓度等条件下复性杂交成双链。此后，经一系列洗涤，将标本中未结合的探针或非特异性杂交的探针全部洗净。
③荧光检测
清洗后的标本用荧光标记的试剂进行检测，对生物素标记的探针一般用荧光标记的卵白素检测，而其他中间分子，主要采用荧光标记的相应抗体来检测。常用的荧光标记分子有AMCA(蓝光)、异硫氰荧光素(绿光)、罗丹明(红光)、德州红(深红)等。
④染色体显带
通常在杂交后显带，如先进行常规显带，再进行FISH会明显降低杂交信号的检出率。常用的显带方法包括：Actinomycin／DAPI显示G带、经溴脲嘧啶处理后再由Hoechest显示R带。或采用Alu或Line重复序列与探针同时进行杂交，亦可得出显示G带或R带的效果。
⑤荧光显微镜检测
荧光染料受到特定波长的光波激发便会在其所排布的位置上发光。此时选择合适的滤色镜，可在同一分裂相上观察到不同颜色的标记物。荧光镜检时显微镜的质量及滤片的选择至关重要，特别是滤片系统，应严格按照相应荧光分子的荧光激发／发射光波长，选择最适的激发／阻挡滤片组合。摄影记录系统由于固态电荷耦联扫描装置及图像分析仪的应用，可以使背景着色很大程度地减低。应用激光共轭聚焦显微镜，可通过对染色片标本的不同平面进行断层扫描，并将得到的结果经计算机处理，获得高质量的图像结果。
4．基因差异分析
分子生物学的许多杂交、扩增技术都依赖于特定的探针或引物，才可检测到基因改变的情况。而某一基因的探针或引物的设计是在对该基因序列有一定了解的前提下进行的。对于未知序列的分析，此类方法往往无用武之地。各种化学毒物和环境危害因素引起的基因改变或新基因的出现大多是未知的。对于此类基因的分析更多应用的是差异分析技术。
目前应用较多的是mRNA差异显示法以及新近发展的cDNA代表性差异分析法。
(1)mRNA差异显示法
IJiang和Pardee等于1992年最早报道了差别显示法(DDRT—PCR，mRNA differential dis—play)。其一般原理是，对mRNA进行反转录合成cDNA，在此基础上对每一类cDNA的PCR选择性扩增产物进行凝胶电泳分析，寻找差异片段。该方法主要由以下三部分组成：
①用3’锚定引物对DNA进行逆转录； ②用3，锚定引物及若干数量一定长度的5’随机引物对逆转录后的cDNA进行PCR扩增，以获得代表不同mRNA的cDNA片段；
③用测序胶分离PCR扩增后的cDNA片段，得出的差异片段在相同条件下再进行PCR扩增、分离、纯化、克隆和测序，即可得到差异片段的序列。
差别显示技术的不足之处主要是高频率的假阳性，有时甚至高达70％以上。为了消除假阳性，应严格设置对照。Sompayrac(1995)曾提出一些降低假阳性的策略。近几年来随着此项技术的应用日益广泛，其方法也在不断改进之中。
(2)cDNA代表性差异分析法
1994年Hubank等建立cDNA代表性差异分析(cDNA—RDA，cDNA representational differ。。。。。．d。。lv。i。)。该技术的基本原理是将差减杂交与PCR有机结合，利用双链DNA为模板时可通过PCR呈指数扩增，而单链DNA为模板时呈线性扩增的原理，首先制备cDNA并用限制性内切酶消化成平均长度为256bp的cDNA片段，随后利用PCR技术使cDNA片段得以富集。接着连续进行3次差减杂交，最后再利用PCR技术富集特异表达基因。
差减杂交法的工作过程是：从基因表达特异的组织中提取mRNA，反转录为cDNA，然后与基因无特异表达的组织中提取的mRNA过量杂交，在基因特异表达的组织与基因无特异表达的组织中均表达的基因产物形成了cDNA／mRNA双链杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。
由于。DNA—RDA能发现与表型相关的基因异常，并能随基因表达的时效性不同而分离出表达差异的基因，从而对基因的结构和功能有更多的了解。与mRNA差异显示法相比，由于RDA进行了消减杂交，从而大大地减少了mRNA差异显示中易于出现的假阳件结果。同时，由于消减富集和PCR动力学富集的特点，可使mRNA差异显示法中难以显示的稀有mRNA的cDNA得以富集并予筛选和克隆。
在毒理学领域，基因差异分析用于寻找外源化合物或环境诱导基因的研究才刚刚开始，但由于其在寻找未知新基因方面的独特优势，必将为分子毒理学的深入研究做出贡献。
5．基因芯片检测
基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片。基因芯片技术是新近出现的将计算机科学、核技术、物理学、数学等学科的多种理论和技术有机结合而发展起来的具有划时代意义的新的基因分析方法。它将成千上万个寡核苷酸固定在厘米大小的硅片上，将待测的材料用荧光素或核素标记，在基因芯片上与探针杂交，通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描获取杂交探针的荧光信号。其制作方法包括：原位合成法(in situ sy。nthesis)、离片合成法(off chip synthesis)及大规模的cDNA微排列。基因芯片的突出特点是可准确地确定突变位点及突变类型，尤其是可以同时检测成千上万个基因乃至整个基因组的所有突变。它将核酸样品制备、核酸扩增和定性定量检测等一系列繁复的过程连续化和微型化，使其高度集中在一块数英寸大的固相支持物上，可用于DNA测序、转录情况分析、基因诊断与基因药物分析设计、突变及多态性检测遗传作图等方面的研究。
二、有害微生物的PCR检测
PcR(I)olyITleIas~j chain reaction)即聚合酶链式反应，是20世纪80年代发展起来的一
种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也称为无细胞克隆系统。它可以在试管中建立反应，数小时后能将极其微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，并且无须通过烦琐费时的基因克隆程序便可以获得足够数量的精确的DNA。随着人们对食品安全性要求的不断提高，PcR技术以其特异性强、灵敏度高和快速准确等优点在食品有害微生物检测领域得到广泛的应用。
1．PCR的技术原理
根据已知的待扩增DNA片段序列，人工合成与该DNA两条链末端互补的两段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增，这种方法也就是PcR技术。扩增过程中高温变性(denatu ration)、低温退火(annealing)和适温延伸(extension)等3步反应作为一个周期，反复循环，从而达到迅速扩增特异性DNA的目的。高温变性是在体外将含有需扩增目的基因的模板双链DNA经高温处理，分解成单链模板；低温退火降低反应系统温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物与目的DNA互补结合，形成部分双链；适温延伸是将反应循环系统的温度调至适温，在Taq DNA聚合酶的作用下，有4种核苷酸存在时，引物链将沿着5’一3’方向延伸，形成与模板互补的新链，新链又可作为下一次反应的模板，如此周而复始使目的基因的数量呈几何级数扩增。在扩增初期，目的DNA分子呈几何级数2“(n为循环次数)增加，随着循环次数增加，模板DNA不断增加和酶分子的消耗，扩增效率下降，DNA分子呈线性(1+x)”增加(x为DNA分子实际增长率)，经过20～30次循环，单一拷贝的基因可扩增10‘～2×10‘倍。
PcR技术检测的主要步骤为：①运用化学手段对目标DNA提取；②设计并合成引物，引物设计与合成的好坏直接决定PcR扩增的成效，通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域，长度为15～30个碱基为宜；③进行PCR扩增；④克隆并筛选鉴定PcR产物，将扩增产物进行电泳、染色，在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带，根据该带的不同即可鉴定不同的DNA；⑤DNA序列分析，不同的对象如扩增DNA片断序列全知、半知或未知，其PcR参数、退火温度、时间、引物等都有较大的差别，将限制片长多态性(RELP，。restriction fragment，length poly-一morphysm)、序列测定(Sequenc~：)、反转录PcR(RT—PCR)等技术相结合，形成了众多的衍生技术，如巢式PCR(nested PCR)、定量PCR(quantitatjveP(：R)、竞争PCR(competitiveP(：R)、单链构型多态性PcR(SS(：P—PcR)等。这些技术的产生将使PcR技术在食品中的应用潜力更加广泛。
2．PCR在食品有害微生物检测方面的应用 在食品有害微生物检测方面，PcR常用于鉴定某些人工培养困难、不能活体检查或分离困难且菌数较少的细菌疾病的检测。PcR用于DNA病毒的检测一般无需提取DNA，可直接取少量样品，煮沸变性后进行PcR测定。PcR用于RNA病毒的检测，必须提纯病毒RNA，在PcR扩增前需转录成cDNA，再加入与cDNA互补的另一引物，用PcR扩增出嵌合分子即逆转录PCR(RT—PCR)。
传统方法检测食品中致病菌的步骤烦琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用PcR技术，只需数小时就可以电泳法检测出0．1 mg DNA中仅含数个拷贝的模板序列。用PcR扩增细菌中保守的rDNA片段，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。
用PcR检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的DNA释放，纯化后经PCR扩增细胞靶DNA的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。对于食品体系的微生物检测，通常可采用预增菌培养程序，既增加了目标微生物的量，又去除了食品体系中存在的抑制因子，大大提高了检出率。 ．
(1)检测单核细胞增生李斯特菌
单核细胞增生李斯特菌是食品卫生中的重要病原菌，多通过食品经口感染，被列为20世纪90年代食品中的4大病原菌之一。有关单核细胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、禽、蔬菜的研究国内外均有报道。该菌可诱发食物中毒，导致李斯特菌病，主要引起人类脑膜炎、菌血症等，发病率虽低，死亡率却高达30％～70％。在食品李氏杆菌的检测中，过去一直缺乏简单快速的分离鉴定技术，传统方法从食品中分离、鉴定该菌约需1～2周才能得出结果，免疫学方法和基因探针已用于该菌的快速检测，但前者可达到属水平的特异性，后者敏感性差。PcR技术的引入可使检测过程大为缩短。李氏溶血素0基因与内化素基因是单核细胞增生李斯特菌最主要的致病因子与侵袭因子，针对其毒力基因可设计特异性高的引物，快速扩增。有报道对食品中李氏杆菌的溶血0基因进行PcR扩增，结果可在12h内完成整个检测过程，对食品样品中李氏杆菌的检测限可达5～50个细菌。
(2)检测金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌是各种类型感染和食物中毒的病原菌，能在食物内增殖并产生体外毒素——肠毒素、内毒素——中毒休克综合症毒素和脱皮毒素。目前金黄色葡萄球菌肠毒素D的鉴定主要依赖于免疫学技术，该技术需要细菌纯培养和制备肠毒素，实验周期长、步骤繁多，使其在食品卫生学鉴定时受到限制。近年来PCR技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径。
(3)检测沙门菌
沙门菌是一种人畜共患的传染性病原菌，近年来，对沙门菌快速诊断的方法已有了很大进展，如应用ELlsA法、EIA技术、间接血凝抑制试验、HRP—SPA染色法和PcR技术等。PCR技术由于具备高度特异、灵敏和快速的特点，已引起越来越广泛的重视。
(4)柃测致病性大肠杆菌
肠毒素大肠杆菌是弓I起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病原菌之一。该菌可产生2种肠毒素：热敏性肠毒素和耐热性肠毒素，它们均能引起肠黏膜细胞水与电解质的代解紊乱并导致腹泻。肠毒素大肠杆菌引起的腹泻主要是食入了被该菌污染的食品所致。PCR技术为临床和实验室提供了一个更为快速灵敏的检测手段。
(5)检测志贺氏菌
该菌的致病性主要由其质粒决定，而传统方法的选择性富集培养易丢失质粒。PcR技术克服了这一缺。PCR扩增及凝胶电泳分析检测中心质粒DNA的分离，可在6～7h完成，而从抽样到最后出结果也不到1天时间。
(6)检测肉毒梭状芽孢杆菌
肉毒梭状芽孢杆菌产生的肉毒神经毒素，在天然物质中毒力最强。依据抗原性不同，肉毒毒素分为A，B，C，D，E，F和G7型，分别由A～G型肉毒梭菌(clostridium b。tulinum)产生，其中A，B,E和F型能引起人类肉毒中毒，致死率很高。肉毒梭菌一直缺乏有效的快速检测方法，用常规方法从食物中分离鉴定出肉毒梭菌至少需要4d，不能达到快速监测食品的目的。经设计引物扩增持异片段，实现了对食品中肉毒梭菌的快速、敏感、特异性地检测。
3．存在的问题及展望
PCR技术虽为一种快速、特异、灵敏、简便、高效的检测新技术，但其在食品中致毒、致病性微生物检测的实际应用中也存在不少问题，必须认真分析各种具体情况，采取必要的措施，以提高反应的特异性和敏感性，避免假阳性或假阴性结果。
(1)污染问题。PCR是一种极为灵敏的反应，一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果，所以在操作时必须加以注意。
(2)假阳性问题。食品是复杂的反应基质，影响PCR反应的因素很多，如果不能有