效排除各影响因素的干扰，很可能出现假阴性结果。此外，如果在PCR操作过程中各种实验条件控制不当，很容易导致产物突变，也会导致假阴性结果。对于这些问题必须有充分的考虑和排除措施。
(3)引物设计及靶序列选择。引物的设计及靶序列的选择是决定PCR结果的关键因素，引物不同则扩增物不同，如果引物的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低PCR检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因而必须对扩增序列有充分的了解，并规范PCR实验室操作计术。
(4)模板DNA的制备方法。肉类等食品增菌液中含有的油脂等杂质可抑制Taq酶活性，影响PCR反应的正常进行。如用煮沸裂解法直接制备DNA模板，油脂等杂质难以除去，会影响检测结果。因此，必须采用适当的模板DNA制备方法。有研究发现，采用快速裂解吸附法制备DNA模板，经过2次清洗步骤可有效去除杂质，反应干扰小，稳定性好，所获得的模板可保存较长时间。
(5)灵敏度问题。食品的成分极为复杂，其中许多成分都对PCR反应产生干扰作用，从而降低PCR检测的灵敏性。为了提高检测的灵敏度，在PCR扩增前往往需要进行增菌培养。如果不进行增菌培养而直接对样品进行检测，其检出限可相差5个数量级。结合PCR技术与免疫磁性分离技术建立的MIPA方法，可不经增菌程序，提高可利用模板数量，去除食品成分干扰，达到较好的检测灵敏度。
(6)检测效果。PCR方法只能检测微生物的存在与否，而不能检测微生物产生的毒素，因而PcR技术用于致毒性微生物污染的食品的安全性检测方面，尚存在两个问题。其一，致毒性微生物检测结果为阴性的食品并不能排除存在毒素的可能，因此检测结果为阴性的食品并不一定是食用安全的食品；其二，致毒性微生物检测结果为阳性的食品中不一定都含有微生物毒素。对前一种情况，PcR检测不具诊断价值，需用小鼠致死试验或免疫学方法检测毒素。对后一种情况，PcR检测具有参考价值，因为食品中存在引起食物中毒的潜在因素。这表明，对于致毒性微生物安全性的检测，不能仅以PcR的检测结果为依据，还需要结合对毒素物质的检测结果进行综合判断。
尽管PcR技术在食品的微生物安全性检测方面还存在着一些问题，但相信随着研究的深入，这项技术必将得以完善，并迅速成为可以信赖的快速检测手段。
三、转基因食品PCR检测
自1983年世界上试验成功第一棵转基因植物以来，以转基因技术为核心的现代生物技术迅猛发展。近年来，利用重组DNA技术研究开发的转基因食品快速发展，有些商品已经被批准商业化，并且开始进入普通消费者的餐桌。尽管多数学者认为转基因食品是安全的，但在过敏性、毒性、致癌性、食品营养品质改变以及环境等方面，仍存在不少争议。目前，对转基因食品各国普遍的态度是：对相关食品必须给消费者真实而明确的信息，大多数国家要求对转基因食品进行标识。
挪威是世界上第一个要求对转基因食品进行标识的国家，规定转基因成分的标识限量为2％，欧盟和日本分别为1％和5％。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因生物，应当进行标识；未标识和不按规定标识的，不得进口和销售。因此必须对转基因食品进行有效的检测。
从转基因技术建立之日起，转基因检测技术亦随之建立。目前主要有两类转基因检测方法：
基于特异性DNA片段的PCR检测技术和基于特异性蛋白的EuSA(enzyme：一linked immunosor—bent assays)检测方法。两种方法的出发点不同，各有优缺点。ELIsA分析法检测的特异性蛋白主要是外源目的蛋白和一些报告基因所表达的蛋白，尤其适用于无需加工的原料性食品，但对于加工品则有局限性。因为重组基因产物会因加工(特别是高温)处理而失
活、分解或消失而使检测的不确定性增加，假阴性率增高。PcR法检测特异性DNA片段包括外源启动子、终止子、报告基因和目的基因。PcR法也不完全适用，因为核酸也会被降解，但其灵敏度高、适用范围最广，目前仍是对转基因食品最常用的检测方法。
转基因食品(GM0，genetically modif'ied organism)的PcR检测分成三个层次：首先要求检测出是否含有转入的外源基因，判断是否为转基因产品，即定性检测。一旦确定为转基因产品后，需要进一步明确两个问题，首先要确定是哪种转基因产品，特别是要确认是否为已批准的转基因产品，即要进行转基因产品品系的检测鉴定；鉴定了转基因产品品系，并确认为已批难的转基因产品后，往往还要检测出其中转基因产品的含量，以明确是否达到需标识的含量(阈值)，即需要进行定量检测。
目前，对转基因食品的检测主要有以下几种PcR方法。 1．定性PCR技术
由于定性PCR所需设备简单，试剂也相对便宜，因此是目前转基因检测中最为常用的方法之一，一些国家将其作为有关食品法规的标准检测方法。定性PcR常以启动子、终止子、报告基因、目的基因等特异性DNA片段作为检测目标。统计表明，[实时荧光聚合酶链反应(PcR)检测技术]CaMv35S启动子、FM V35S启动子、Nos终止子、唧￡Ⅱ、c，)，3A、Bar和Pat这7种基因片段用做筛查目的靶核酸序列时可覆盖绝大多数的GM0品种。在实际检测中，可以根据以上7种基因片段设计引物和探针进行筛检。多重PCR经过一次扩增可同时得到多个所需的DNA或基因序列，对于检测是否含有转基因成分的DNA样品明显减少了反应次数，大大节省了时间和精力。但由于PcR的高灵敏度已造成假阳性现象，以及由于操作失误和一些反应抑制因素带来假阴性现象，各个实验室间常存在一定误差，且不能用于定量分析，使该法具有一定的局限性。
2．竞争定量PCR法(quantitative competitive PCR)
随着各国有关转基因成分标签法的建立和不断完善，对GM0的准确定量检测变得日趋重要。一些定量PcR技术相继发展起来。竞争定量PcR就是其中一种。竞争定量PcR法的原理是采用构建的竞争DNA(往往与样品DNA具有相同的引物结合序列，但大小相差一定bp，便于电泳时分开)与样品DNA在同一体系中相互竞争相同的引物和底物，并根据电泳结果做工作曲线，从而得到可靠的定量分析结果。该法对实验仪器的要求不高，与定性PcR相比，降低了抑制因素的影响以及实验室问的误差。不足之处是需要用基因重组技术构建竞争DNA，对一般实验室来讲难度太大，且定量程度难以提高。
3．实时定量PCR(real—timc：PCR)
上述这些方法进行检测时都依赖于各种不同类型的PcR后处理过程，而这些处理过程很易使数量巨大的PcR产物飞散到空气中，使PcR假阳性污染成为可能，尤其是电泳所用的染色剂EB(溴化乙锭)为强烈致癌物质，若操作不当，会严重危害操作者的健康。
另一方面，竞争定量是针对PcR终产物来进行的，而PcR的平台效应在一定程度上干扰了PcR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。与这些传统方法不同，实时定量PCR方法采用完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染。采用实时监测技术，从检测开始到定量结束，整个过程耗时短，操作方便。
目前，用于转基因产品实时定量检测的RcR仪主要有：(1)ABI公司生产的ABI Prism 5700型、7700型、7900HT型PcR仪；(2)Iloch~：公司生产的Light：(~ycler-PcR仪。这两种PcR仪既可用于转基因产品的定性筛选，也可用于转基因产品含量的定量检测及品系鉴定。
不同的厂家生产的实时定量PcR仪其荧光探针的设计和荧光信号的监测机理不尽相同。下面以ABI公司生产的ABI Prism系列PcR仪为例说明实时定量PcR原理。
ABI Prism系列荧光定量PcR仪采用的是TaqMan实时荧光PcR技术，它是在常规
PcR方法基础上，添加了一条标记了2个荧光基团的探针来检测PcR产物的数量。荧光报告基团(R)标记在探针的5’一端，荧光淬灭基团(Q)标记在探针的3’一端，两者可构成能量传递结构，即荧光报告基团所发出的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在PcR过程中，TaqMan探针同PcR产物杂交，由于Taq酶具有5’一到3’一的外切酶活性，在引物延伸阶段将TaqMan探针切断，荧光淬灭基团(Q)淬灭作用消失，报告基团荧光信号增强。伴随PcR产物的增加，荧光信号随之增强，第n循环时的荧光信号增加值△R等于Rn／Qn一R0／Q0，Rn，R0分别为第n循环和PcR反应开始时的报告基团荧光值。Qn、Q0分别为第n循环和PcR反应开始时的淬灭基团荧光值。PcR反应的第3～15个循环的荧光值作为荧光本底信号，3～15个循环的△R。的标准偏差的10倍被设定为荧光阈值(threshold)，当信号达到该荧光阈值时的循环次数(G，值)同PcR反应的初始模板量成正比。
通过检测作物本身所具有的内源参照基因(endogenous reference：gene)，如玉米醇溶蛋白(zein)基因、高速泳动蛋白(HMG prote]’n)基因、大豆凝集素(1ecl：in)基因，可以测定样品中转基因作物和非转基因作物的总DNA模板量；通过检测转基因作物中转入的外源基因，如CaMv35S启动子、CP4一EPSPS基因、c叫LA(6)基因等可以测定样品中转基因作物DNA模板量，通过建立转基因作物标准参照样品的内源参照基因与外源基因c，值之差(△c，)与转基因成分百分含量的标准曲线，可以计算出样品中转基因成分的百分含量。
TaqMan探针技术巧妙地运用了PcR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。