水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定
1、
实验目的
1.1学习水样的采取方法、了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
1.2学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。 1.3学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。 2、
实验原理
2.1水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大。所谓细菌总数是指1mL或1g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数。本实验所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。
2.2所谓大肠菌群，是指在37℃、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
2.3水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验。
2.3.1初发酵试验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉式小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖产酸产气。培养基内加溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基由紫变黄。发酵管经37℃培养24h，小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明说中存在大肠菌群，为阳性结果。但是，有个别其他类型的细菌此条件下可能产气，且产酸不
产气的发酵管，也不一定非大肠菌群，因其也可能延迟48小时才产气，这两种情况应视为可疑结果，因此需继续进行下面实验，才能确定是否为大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。
2.3.2平板分离
伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落。
2.3.3复发酵试验
将以上证实为大肠菌群阳性的菌落，接种复发酵，其原理与初发酵相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据确定有大肠菌群存在的初发酵管数目，查阅专用统计表，得出总大肠菌群指数。 3、
实验器材 3.1培养基
3.1.1普通乳糖蛋白胨培养液
蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6％溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.2~7.4。
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有德汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。
3.1.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有德汉氏小管的试管中，每管5mL。
3.1.3伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵法平板分离用）
蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2％伊红（曙红）水溶液 20mL，5％美蓝（亚甲蓝）水溶液13mL，pH 7.2~7.4。
3.2溶液和试剂
自来水、奶茶、池塘水、革兰氏染色液、无菌水等 3.3仪器和其他用品
显微镜、载玻片、灭菌三角瓶、灭菌带塞空瓶、灭菌移液管、灭菌试管、德汉氏小管、、灭菌培养皿。 4、
操作步骤 4.1水样的采集：
4.1.1自来水：先将自来水龙头用火焰灼烧3分钟灭菌，再开放水龙头使
水流五分钟后，在火焰旁打开灭菌三角烧瓶瓶塞，接取水样以备分析。
4.1.2池塘水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭
菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。
4.1.3 奶茶：在无菌操作下，将已封闭的饮料打开，在火焰旁用三角瓶取样，并迅速进行分析
4.2 水样中细菌总数的检测 4.2.1 自来水中细菌总量的检测
4.2.1.1用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平
皿。
4.2.1.2分别倾注约15ml已溶化并冷却到45度左右的牛肉膏蛋白胨
琼脂培养基，并立即放在平整的桌面上，做平面旋转摇动，使水样与培养基充分混匀。
4.2.1.3另取一灭菌培养皿，不加水样，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
15ml，做空白对照。
4.2.1.4培养基凝固后，倒置于37度，培养24小时，进行菌落计数。
两个平板的平均菌落数，即为1ml水样的细菌总数。
4.2.2水样稀释及培养：
4.2.2.1 按无菌操作法，将水样按10倍稀释法稀释。
4.2.2.2根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(奶茶选
择1：10、1：100、1：1000；池塘水选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个重复。
4.2.2.3将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每
皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
4.2.2.4待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24h后取出，
计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
4.2.3稀释水样检测平板的菌落计数方法。
4.2.3.1平板菌落数的选择：
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
4.2.3.2稀释度的选择：
4.2.3.2.1若只有一个稀释度的平均菌落数在30-300之间，则以该
稀释度乘以该稀释倍数 (表1例1)。
4.2.3.2.2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则
视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应取其平均数；若比值大于2，则取其中较小的数字(表l例2、例3)。
4.2.3.2．3若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应取稀释倍数
最低的平均菌落数乘以稀释倍数 (表l例4)。
4.2.3.2．4若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数
最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(表1例5)。
4.2.3.2.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最
接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例6)。
表 1 计算菌落总数方法举例
列次 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释度菌落数菌落总数/（cfu/mL） 备注 10 -110 -210 -3之比 16400或两位以后41 1365 164 20 - 1.64×10 的数字采取四舍五37750或2 2760 295 46 1.6 3.8×10 27100或3 2890 271 60 2.2 2.7×10 513000或4 无法计数 1650 513 - 5.1×10 270或5 27 11 5 - 2.7×102 544入的方法 30500或6 无法计数 305 12 - 3.1×10 4 4.3多管发酵法测定水中总大肠菌群 4.3.1自来水样的检测 4.3.1.1初步发酵试验：
在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。摇匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养48h。
4.3.1.2平板分离：
将经24h培养后产酸产气及48h培养后产气产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18-24h。将符合下列特征菌落：呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
4.3.1.3复发酵试验：