简述基因克隆的两个基本特征？
基因克隆的两个基本特征是一是强调外源核酸分子（一般情况下都是 DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的一个重要特征，基因操作的另一个重要特征是繁殖。
如何理解 gene 及其产物的共线性和非共线性？
基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。在原核生物中，基因及其产物是共线性的。 70 年代以来，在真核生物中，发现了间断基因，后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就是后来所说的基因间存在着内含子。内含子指真核生物基因中不能被翻译成蛋白质的 DNA 片断，但可被转录，当两侧序列的转录 RNA 被剪接在一起时，就将内含子转录的 RNA 从整个转录物中除去。外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。内含子并不是一成不变的，具有相对性，对一个 DNA 片断来说，在某个基因中是内含子，但在另一个基因中却可以作为外显子。
什么是 gene cloning ？什么是亚克隆（subcloning）？
基因克隆：一定程度上等同于基因的分离，即从复杂的生物体基因组中，经过酶切，消化等步骤，分离带有目的基因的 DNA 片段。基因亚克隆：初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
假如从一个原核生物中 cloning 某基因（1-2kb），请谈谈它的基本步骤？
①对原核生物染色体 DNA 进行不完全酶切，纯化所得到的 DNA 片断，并与载体连接，转化大肠杆菌；②得到转化子后，根据目标基因两侧的已知序列设计探针，杂交，筛选转化子；③所得到的转化子中含有目标基因，进一步作亚克隆，一步步地向目标基因逼近，最后可得到目标基因
什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈 Gene Engineering 诞生的基础？ 基因工程（Gene Engineering ）又称基因操作（Gene Manipulation）、重组 DNA 。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA 分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子，然后导入活细胞，以改变生物原先的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。
思考题问题： 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
思考题问题： 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？ 思考题问题： 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
简述限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的概念及其生物学功能？
定义：指识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶。生物学功能：保护宿主不受外来 DNA 分子的感染，可降解外来的 DNA 分子，从而阻止其复制和整合到细胞中。 PCR 引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？ 限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加 3～4 个碱基。
试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素？
外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象。
在酶切缓冲液中，一般需加入 BSA，请问加入 BSA 的作用是什么？并简述其原理？
作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用。限制性内切酶在稀释液中会迅速变性， BSA 是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。
何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/ml）；③低离子强度（<25mM）；④高 pH (>8.0)；⑤有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）和 sulphalane 等；⑥用其它二价阳离子 Mn2+、Cu2+、Co2+ 或Zn2+ 代替 Mg2+ 。星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到 100～150mM （在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应 pH 至 7.0 ；⑤使用 Mg2+ 作为二价阳离子。
某 DNA 序列中存在 DpnI 酶切位点，以此 DNA 为模板，在体外合成 DNA 序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？
生物体内的 DNA 序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化的限制酶 DpnI 来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的情况。
天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？
在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。①将产生的 5' 突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点；②同尾末端的连接，不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失；③平末端的连接
双脱氧终止法测定 DNA 序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知识测定较长片段的 DNA 序列？ ①将所需要测序的 DNA 片断采用 2 种不同的限制性内切酶切割，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的 DNA 序列；②用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与载体连接后，测序，拼接，即可得到全长 DNA 片断。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的酶切片断能覆盖所需测序的 DNA 片断。
大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ，具有 3'--5’外切活性和 5'--3' 的聚合酶活性以及 5'--3' 的外切活性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途? ①利用 E.coli DNA 聚合酶 的 5'--3' 外切核酸酶活性，可用切口平移法标记 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应；②用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性；③对 3' 突出端的 DNA 作末端标记（交换或置换反应）。
用 T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记，试简述其原理？ T4 phage DNA 聚合酶具有 3'--5' 外切活性和 5'--3' 的聚合酶活性， 3'--5' 的外切活性可以被 5'--3' 的聚合活性所封闭，首先在反应体系中加入一种 dNTP ，产生 3' 凹端，然后加入经过标记的 dNTP ，利用 T4 phage DNA 聚合酶的聚合活性补平 3' 凹端，即可得到标记了末端的 DNA 片断。
BAP 和 CIAP 有何作用？为何一般采用 CIAP 而不采用 BAP ？ 作用：催化除去 DNA 或 RNA 5' 磷酸。BAP 抗性强，抗高温和去污剂。 CIAP 可用蛋白酶 K 消化灭活，或在 5mM EDTA 下，65℃ 处理或 75℃ 处理 10 分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的 DNA ，从而去除 CIAP 的活性。相比之下， CIAP 比 BAP 更易去除，因此，一般采用 CIAP 。
依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶包括 SP6 噬菌体 RNA 聚合酶和 T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？ ①将 T7 RNA 聚合酶基因置于 E.coli lacUV5 启动子之下，插入到 λ 噬菌体中，感染 E.coli ，建立稳定的溶源菌。 E.coliBL21（DE3）菌株即为将 lacUV5 启动子和 T7 聚合酶基因置于 λ 噬菌体 DE3 区，该 λ 噬菌体 DNA 整合于染色体的 BL21 处。若将 T7 噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中，在 IPTG 诱导下，可启动外源基因的表达；②先导入带 T7 噬菌体启动子控制的目的基因的质粒，再用 λ 噬菌体（带 T7 RNA 聚合酶基因）感染 E.coli ，激活目的基因的表达。
简述 T4 多核苷酸激酶的活性和用途？
T4 多核苷酸激酶的活性催化 ATP 的 γ－磷酸基转移到 DNA 或 RNA 的 5' 末端。可表现为两种反应，正反应指 ATP 的 γ－磷酸基被转移到去磷酸化的 DNA 5' 端，用于对缺乏 5'－磷酸的 DNA 进行磷酸化。在交换反应中，过量的 ATP 可使该激酶将磷酸化的 5' 端磷酸转移给 ADP ，然后 DNA 从【γ－32P】ATP 中获得放射性标记的 γ－磷酸而重新磷酸化，因此可用于 DNA 的末端标记。用途：该酶主要用于对缺乏 5'－磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。通过交换反应，用于标记 5' 末端，以供 Maxam－Gilbert 法测序、 S1 核酸酶分析以及其它须使用末端标记 DNA 的步骤。
思考题问题： 限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有何特点？ 思考题问题： 哪些酶可用于DNA片段的末端标记？
思考题问题： DNA 聚合酶有哪些类型，各有什么活性？ 思考题问题： 在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？
何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？
将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源 DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。
含 pMB1 或（ColE1）复制子的 plasmid 是如何复制的，其调节机制如何？
复制方式：在复制时，首先合成前 RNAⅡ ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后 RnaseH 切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的 RNAⅡ ，并形成三叶草二级结构。该引物引导质粒的复制。调节机制：形成的 RNAⅠ 可控制 RNAⅡ 形成二级结构，同时 Rop 增强 RNAⅠ 的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱 RNAⅠ 和 RNAⅡ 之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。
当向细菌培养基中加入氯霉素时，可以使细菌质粒的拷贝数得到扩增，试分析其原理？ pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ， DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、dnaC 、dnaD 和 danZ 的产物。因此，即使存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有 pMB1（或 ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚 2～3 千个质粒。
抗性基因（Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？
氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr , neor）以及琥珀突变抑制基因 supF 。青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽
反应并抑制其活性。 Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化 β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
何为 α-complement ？如何利用 α-complement 来筛选插入了外源 DNA 的重组质粒？
α-complementation 指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。 α-complementation 是基于在两个不同的缺陷 β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现 α-complement 主要有两部分组成： LacZ△M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代； LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无 α-complement 能力的 β－半乳糖苷酶片断。在诱导物 IPTG 和底物 X-gal（同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的 β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。
为什么野生型的 λ 噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体？
参考答案： ①野生型噬菌体 DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对 DNA 包装的量是有限制的，不能大于基因组的105％，所以要将 λ 噬菌体改造成载体，必须削减分子量；②野生型的 λ 噬菌体对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；③没有可供选择的标记；④野生型的 λ 噬菌体具有感染性，因此不够安全。
试简述 λ 噬菌体的 Lytic growth 和 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ Lytic growth 是 λ 噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代 λ 噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。 Lysogenic state 为 λ 噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体 DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程： 由感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化的频率就越高。溶源现象的生化媒介可能是 3'--5' cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP 的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏 cAMP 的突变细胞中，更有利于裂解生长另外一个重要的调节因素是噬菌体的 CⅡ 蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体 DNA 整合到细菌的染色体中去。高浓度的 CⅡ 蛋白促进溶源化，而低浓度的 CⅡ 蛋白促进裂解生长。当 CⅡ 蛋白浓度足够时，激活 CⅠ蛋白和基因 int 的表达，导致噬菌体 DNA 与染色体整合，朝着溶源态生长。
用 λ 噬菌体载体进行 gene cloning 时，主要利用 λ 噬菌体的生物学特性作选择标记，其中有 cI 失活和 Spi 筛选，请问什么叫cI筛选？什么叫 Spi 筛选？
CⅠ 蛋白控制溶源态的形成，裂解生长受到抑制，当外源基因片段插入 cⅠ 中， cⅠ 蛋白失活，溶源态打破而进入裂解生长而筛选出重组克隆，叫做 cⅠ 筛选。野生型噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（ sensitive to P2 interference ）。如果 λ 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，同时带有 chi 位点，并且宿主菌为 rec+ ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，噬菌体的这种表型称作 Spi- 。因此，通过 λ 噬菌体载体 DNA 上的 red 和/或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组 λ 噬菌体。
简述 λ 噬菌体载体的克隆原理及一般步骤？
λ 噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆 DNA 片断。工作原理： λ 噬菌体载体克隆外源 DNA 片断的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是在形式上有许多差别。载体和外源 DNA 片断经过酶切后，外源 DNA 片断插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段。这种连接后的重组 DNA 保留增殖性能，但由于分子量太大，不能象重组质粒 DNA 那样可通过转化方法进入大肠杆菌。通过提取 λ 噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重组噬菌体 DNA 进行包装，形成噬菌体颗粒。这样的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，可将被包装的重组噬
菌体 DNA 注射到宿主菌中。通过裂解生长，可增殖重组噬菌体。克隆步骤：①通过裂解过程增殖载体；②载体与外源 DNA 的酶切；③外源 DNA 与载体的连接；④重组噬菌体的体外包装；⑤包装噬菌体颗粒的感染；⑥筛选。
Cosmid 的工作原理是什么？
粘粒载体的主要原理类似 λ 噬菌体载体。在外源片断与载体连接时，粘粒载体相当于 λ 噬菌体载体的左右臂， cos 位点通过粘端退火后，再与外源片断相间连接成多联体。当多联体与 λ 噬菌体包装蛋白混合时， λ 噬菌体 A 基因蛋白的 terminase 功能将切割两个 cos 位点，并将两个同方向 cos 位点之间的片断包装到 λ 噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组 DNA 就象 λ 噬菌体 DNA 一样，被注入细胞并通过 cos 位点环化。这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。通过这种方式，就将外源 DNA 片断通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中去了。
构建粘粒文库时会遇到哪些问题？你如何解决？
利用粘粒构建基因文库时会遇到许多困难：①载体分子会自身连接，从而导致效率大大降低甚至失败。通过对载体作去磷酸化处理或使用双 cos 位点载体或对载体的酶切产物进行部分补平可解决这一问题；②多个外源片断插入载体中，会误将两个本来不相连的 DNA 片断认为是基因组中的连续 DNA 片断。通过收集 35～45kb 的部分酶切外源 DNA 片断与载体连接、使用双 cos 位点载体或对载体和外源片断的酶切产物进行部分补平，可解决这一问题。③提取的基因组 DNA 长度小于 200kb ，将使部分酶切后形成的 35～45kb 片断只有少部分在其两端带有酶切位点，致使目标 DNA 的可用性大大降低。在对外源 DNA 片断作部分酶切之前，应检查其大小，如果小于 200kb 则不能用于构建文库；④提取的总 DNA 纯度不高，可能由于出现酶解抑制物而得不到理想的酶切产物。因此，在制备总 DNA 时，应小心避免混入的有机相和水相交界处的物质。如果问题依旧出现，可用氯化铯梯度离心方法纯化 DNA 或重新制备总 DNA ；⑤在构建的文库中常常出现不含外源片断的克隆。这种“空”克隆的比例依载体的不同和操作的小心程度而不同 一般而言，使用单 cos 位点的载体，约有 5％ 的克隆是空的。使用双 cos 位点的载体，产生空克隆的比例要低得多；⑥不同重组质粒拷贝数可以有很大差异，导致收获量相差悬殊。每当对文库作一次噬菌体的扩增，这些差异将会被进一步放大；⑦尽管文库似乎全面，但也许不能获得目的克隆。限制酶位点的非随机分布、包装蛋白污染限制酶、重组引起的序列缺失和扩增时目的克隆可能被淘汰等都是产生这种现象的原因。
丝状噬菌体克隆中经常会遇到哪两类问题？可用何种方法来解决？
①外源 DNA 区段的部分缺失，克隆于丝状噬菌体基因间隔区的外源基因趋于不稳定。外源基因越大，缺失突变率越高，尽量避免带有让感染细菌在液体培养中连续生长，可以使这种现象减少到最低限度（尽管不能完全消除）。正确的做法是，用保存于 －70℃ 的重组噬菌体原种转染适当的宿主菌，铺成平板，并从分隔良好的单个噬斑的中央挑取细菌进行小规模培养；②外源 DNA 总是以单方向插入，实验中经常会遇到，尽管某一载体可能在两个方向上接受 DNA ，但特定外源 DNA 区段却更容易仅以其中一个方向插入该载体，这种情况屡见不鲜。之所以出现这种现象，是因为外源 DNA 另一条链上的序列不同程度地干扰了载体基因间隔区的功能。在多克隆位点区内遴选不同的位点插入外源 DNA ，或者选用可进行定向克隆的限制酶组合，有时可避免上述问题。
噬菌粒（Phagemid）具有那些特征？许多 phagemid 都有一个主要的缺点，即在辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性一般较差，试分析其原因？
①双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；②免却了将外源 DNA 片断从质粒亚克隆于噬菌体载体；③由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链。原因：①噬菌体携带的基因间隔区的确切序