列，携带完整基因间隔区的质粒可由于干扰辅助病毒 DNA 复制而抑制子代噬菌体颗粒的产生；②基因间隔区插入质粒的具体位置，基因间隔区插入 pBR322 HindⅢ 位点所构成的噬菌粒，会严重干扰野生型噬菌体的生长，而将基因间隔区插入 AhaⅢ 位点则不然；③辅助噬菌体的性质，野生型丝状噬菌体及其抗干扰突变株都被用作辅助噬菌体。辅助噬菌体基因间隔区插入了 lacZ 序列，因而基因 Ⅱ 产物对它的识别不那么有效；④克隆于噬菌粒的外源 DNA 的大小与性质，因外源 DNA 片断的大小而异，单链 DNA 的产量可以在 5～10 倍之间有所差异（一般来说，外源 DNA 越大，产量越低）。另外，由于一些尚不清楚的原因，大小相同的外源 DNA ，其单链 DNA 的产量也参差不齐。
YAC 载体具有什么样的功能性元件？为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？ YAC 带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个复制起点，两个端粒。 YAC 能够容纳长达几百 kb 的外源 DNA ，这是质粒和粘粒办不到的。大片断的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时减少完整基因组文库所需的克隆数目。
思考题问题： 作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？ 思考题问题： 何为α-互补？在载体构建中有何作用？
思考题问题： 请简要描述?噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式，及其在构建载体中的作用。 思考题问题： 简述M13K07辅助噬菌体的遗传学特性和生物学功能，及其在制备单链DNA中的作用。
分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片断大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA （5-500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的 DNA ，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行 DNA 电泳。
琼脂糖凝胶电泳中，简述影响 DNA 在凝胶中迁移速率的因素？
① DNA 的分子大小，分子越大，则摩擦阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢；②琼脂糖浓度，一个给定大小的线状 DNA 片断，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同；③ DNA 分子的构象；④电源电压，在低电压下，线状 DNA 片断的迁移速率与所加电压成正比。但是，随着分子量的增加，高分子量 DNA 片断的迁移率将以不同的幅度增长。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小；⑤电场方向；⑥碱基组成和温度；⑦嵌入染料的存在；⑧电泳缓冲液的组成。
CsCl-EB 梯度平衡离心法分离质粒和染色体 DNA 的原理？
① CsCl 是一种高分子量的重金属，在一定的高速离心下，可以自动形成 CsCl 的浓度梯度；②当进行离心时， CsCl 溶液中的大分子物质将根据它本身的密度停留在不同的 CsCl 密度区，形成一个致密带，而不会像 CsCl 一样形成浓度梯度。 CsCl 溶液中大分子到底在何处形成带，将取决于大分子本身的浮力密度。 DNA 的浮力密度大约为 1.7g/cm3 ，离心时将迁移到 CsCl 的密度为 1.7g/cm3 处。与此相反，蛋白质的浮力密度相当低，将漂浮在离心管的顶部。而 RNA 则沉淀于离心管的底部；③溴化乙碇存在的密度梯度离心中，能够将超螺旋的 DNA 与非超螺旋的 DNA 分离开来。嗅化乙碇可嵌入到 DNA 的双螺旋分子中，使 DNA 部分解旋，其结果可使线性 DNA 的浮力密度减少 0.125g/cm3 。由于超螺旋的 DNA 没有游离的末端，解螺旋的幅度有限，也就只能结合有限的 EB ，因此，超螺旋 DNA 的浮力密度只有少许下降，大约为 0.085g/cm3 。结果，超螺旋的 DNA 将与线性、开环的 DNA 在 EB－CsCl 密度梯度离心中由于密度不同而分开。
小量制备质粒 DNA ，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？
①加 solutionⅠ 前，没有用 STE 洗涤，导致细菌菌株的细胞壁成分抑制限制酶的活性；②没有用酚：氯仿抽提蛋白，导致 DNA 能耐受限制酶酶切；③限制酶对甲基化敏感，而所采用的宿主为非甲基化缺陷型，可采用对甲基化不敏感的同裂酶，或换用甲基化缺陷型的宿主菌株。
何谓 RNA 的斑点杂交和狭缝杂交？
将 DNA 或 RNA 样品直接点在固体支持物上，然后与核酸探针进行分子杂交，这种方法称为斑点杂交。如果借用一种模具，将核酸样品加到模具的狭缝中，通过真空抽滤，印迹到滤膜上，然后进行杂交称为狭缝杂交。
以 pUC18 系列为载体，外源基因经酶切和载体连接后，将其导入处于感受态的宿主细胞中，筛选菌落，设计一个实验证明外源基因能在宿主细胞中转录表达。
实验步骤：①将该基因克隆到一个表达载体上，利用表达载体本身的启动子，大量表达目标蛋白；②目标蛋白纯化，制备抗体；③将该抗体与宿主细胞进行杂交，若出现信号，则说明该基因在该宿主细胞中能转录表达，否则，不能转录表达。
简述随机引物标记的原理和步骤？
随机引物是人工合成的长度为 6 个核苷酸的寡聚核苷酸片段群体，含有各种可能的排列顺序（46＝4096）；或是用 DNA 酶处理小牛胸腺 DNA 后获得的 6～12 个碱基的片段。将待标记的 DNA 片段同随机引物一起进行杂交，并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物，在 Klenow 酶的作用下合成互补 DNA 链，当反应底物中有放射性底物 dNTP 时，新合成的 DNA 就带上了标记。
何谓 S1 核酸酶作图？有何应用？
S1 核酸酶作图指：预先判断 mRNA 的端点位置，设计一段覆盖该端点的寡核苷酸，并作末端放射性标记。然后将该标记的寡核苷酸与 mRNA 混合，退火，形成杂交体。在 S1 核酸酶作用下，呈单链状态的 DNA 和 RNA 被降解，保留 DNA-RNA 杂交体双链，最后通过凝胶电泳检测 DNA-RNA 杂交体中标记的 DNA 单链的分子量大小，从而推断 mRNA 的末端序列。
什么是Western blot ？它和 Southern blot 有何区别？
Western blot 是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后利用特异性抗体进行检测。它与 Southern blot 的不同在于探针的性质不同，在 Western blot 中所使用的探针是抗体（蛋白质），而 Southern blot 的探针则是核酸。
思考题问题： 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？ 思考题问题： 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。 思考题问题： 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？ 思考题问题： DNA转化有哪些方法，各有何优点？
PCR 技术的原理是什么？从大的方面讲， PCR 技术可用于哪些领域？
PCR 技术是一种 DNA 扩增技术。它通过温度的变化使得双链 DNA 解链、退火、延伸。通过多次这样的循环，模板 DNA 就可以按几何级数速度扩增。应用于分子生物学和基因工程及其他与 DNA 鉴定相关的领域。 Primer 是 PCR 反应体系的四大要素之一， PCR 的许多应用都是通过 primer 设计来实现的，请问 primer 设计的一般原则是什么？
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；②产物不能形成二级结构；③引物长度一般在 15～30 碱基之间；④ G+C 含量在 40%～60% 之间；⑤碱基要随机分布；⑥引物自身不能有连续 4 个碱基的互补；⑦引物之间不能有连续 4 个碱基的互补；⑧引物 5' 端可以修饰；⑨引物 3' 端不可修饰；⑩引物 3' 端要避开密码子的第 3 位。
在 PCR 反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫 Plateau effect ？产生 Plateau effect 的原因有哪些？
平台效应是指在 PCR 反应后期，产物的积累按减弱的指数速率增大（一般已积累到 0.3～1pmol 产物）。原因为可能为：①底物浓度降低；② dNTP 或酶稳定性降低；③末端产物抑制；④非特异性竞争；⑤特异性产物自身变性等。
在对 PCR 产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到 DNA 带或 DNA 带很弱，那又是为什么？
PCR 扩增有时出现拖带或非特异性扩增条带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，模板中杂质过多， dNTP 浓度过高， Mg2+ 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多等引起。如果检测结果看不到 DNA 带或 DNA 带很弱可能是：①模板中含有杂质；②酶失活；③引物质量不好；④ Mg2+ 浓度过低；⑤反应体积的改变等等；⑥其他的一些物理原因，如复性温度低，变性时间短等或者也可能是由于靶序列的变异等。
通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？
首先，将特异性蛋白进行转膜，然后进行氨基末端测序，依据测序结果设计探针从该植物的 cDNA 文库中筛选阳性克隆（如果没有 cDNA 文库可以先做 cDNA 文库）；最后进行亚克隆，将目标片段转入表达载体上进行表达分析。
由 mRNA 反转录成 cDNA 和 DNA 的 PCR 扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由 mRNA 起始扩增出 DNA ？
RT-PCR 技术是实现由 mRNA 起始扩增出 DNA 的一种实验方法。 RT-PCR 是将 RNA 模板的反转录（Reverse Transcription）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先是以 RNA 为模板，在反转录酶的作用下得到 cDNA ，然后以 cDNA 为模板进行聚合酶链式扩增从而得到目标 DNA 。 RT-PCR 技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选 cDNA 文库而能直接克隆 cDNA 产物。 思考题问题： 如何理解PCR扩增的原理和过程? 思考题问题： 通过PCR技术扩增已知序列侧翼的未知序列的关键问题是什么? 用PCR作染色体步查有何特点? 思考题问题： PCR产物的克隆与一般的DNA片段的克隆有何异同点? 思考题问题： 为什么在定量PCR中要引入Ct值的概念?
用双脱氧终止法测定 DNA 序列时，为何一般需制备 M13 克隆载体而不直接采用双链 DNA ？ 利用 M13 克隆载体可以得到单链 DNA ，方便测序。 简述随机测序的基本原理？
原理：将待测 DNA 克隆于噬菌体载体（M13）上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化，得到两端彼此 重叠的部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。 得到一段未知功能的基因序列，如何对它进行分析？
①基因信息的序列分析。例如，两种序列的比较；基因编码领域，启动子或增强子序列的预测；蛋白质序列的氨基酸顺序的确定；②新基因的发现，通过分析 EST （Expressed Sequence Tag）序列结合 DNA Chip 技术寻找新基因；③基因多型性分析，分析基因多型性特别是 SNP （Single Nucleotide Polymorphi），发现并定位功能性基因，作为人类群体进化，或者疾病关联标记；④高级结构的预测，根据测序所得到的核酸一级结构的信息，可以预测核酸和蛋白质的二级结构及其三级结构，从而预测其功能。根据测序所得到的核酸一级结构的信息，可以预测核酸和蛋白质的二级结构及其三级结构，从而预测其功能。 何谓测序酶？与 Klenow 片段相比，它有何优点？ 测序酶是一种经过化学修饰的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶。与 Klenow 聚合酶相比，该酶的 3'--5' 外切活性完全缺失。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如 dITP 和 7-脱氮－dGTP 等用于提高分辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸具有广泛的耐受性。它是测定长段 DNA 序列的首选酶。 以下为某一 DNA 序列，据此回答下列问题5’--GATCTAAATTCTAGCCTTGAACT---------CATACGGGATTGTTAAATCTAG--3’ 3’--CTAGATTTAAGATCGGAACTTGA--
------GTATGCCCTAAGAATTTAGATC--5’ （1）在 DNA 测序中，引物设计的基本原理是什么？（2）如果你打算扩增上图所示的一段序列之间的 DNA ，你会如何选择引物？
?引物选择的原则：①长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp ，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性；②引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。对于小于 20 个碱基的引物，其 Tm 值可用简易公式计算， Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T )。对于 14-70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。 Tm=81.5 + 16.6( 1g[K+] ) + 0.41( G + C )% - ( 675 / N ) N 表示引物的核苷酸数目，[K+]表示单价离子即钾离子的浓度；③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3 个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。④ G + C 含量：尽量控制在 40%～60% 之间， 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3' 末端的重复排列；⑤引物的 3' 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。
（2） 5'--GATCTAAATTCTAGCCTTGAACT-- 3'； 5'--CTAGATTTAAGAATCCCGTATG--3' 思考题问题： 简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。 思考题问题： 简述将Sanger的测序方法称为双脱氧链终止法的理由。 思考题问题： 采用循环测序法测序时引物的设计有什么要求？为什么？
思考题问题： 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？ 思考题问题： 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段ＤＮＡ的序列？ 什么叫标记获救现象？
70 年代初 φ×174 DNA（ssDNA 5386bp），当用带琥珀突变的 ssDNA 与变性的野生型 DNA 片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象，即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型 DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。由此可利用突变的 DNA 片段将突变引入到野生型 DNA 中。 单核苷酸置换插入或缺失中，引物设计的要求？
5' 端完全配对，使得上游（引物）起始的 DNA 合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需 8－10bp 。 3' 端所形成的杂交体足以引导 DNA 合成。如果错配核苷酸太靠近 3'端， 3' 端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以 3' 端需有 7～9bp 完全配对。为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般 17－19bp ，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。 思考题问题： DNA诱变有哪些种类，各有何特点？
思考题问题： 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？ 思考题问题： 简述Kunkel定点诱变基本原理。
什么是 Gene library ？它与 cDNA library 有何区别？
由大量的含有基因组 DNA （即某一生物的全部 DNA 序列）的不同 DNA 片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。 cDNA 文库：若这些大量的重组 DNA 分子所含的外源 DNA 不是基因组 DNA ，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经反转录形成的 cDNA ，他们所构成的重组 DNA 克隆群体，则称之为 cDNA 基因文库 简述以质粒为载体构建 Gene library 的基本步骤？
①总 DNA 的提取；②载体的制备、纯化；③基因组 DNA 的不完全消化；④载体与外源 DNA 片断的连接；⑤转化受体菌，然后在有选择压力的平板上培养转化了外源基因的受体菌；⑥重组子的鉴定；⑦外源 DNA 进行分析。 采用同聚物加尾的方法进行 dscDNA 克隆，一般采用 dC/dG 而不采用 dA/dT ，简述其原因？
AT 加尾的方法很少用于 cDNA 克隆，这主要是因为找不到满意的方法可将通过 AT 加尾而插入质粒中的 cDNA 切下来；文献中（Hofstetter 等， 1976）介绍的方法效果不佳，且重复性通常较差。于是，多年以来，几乎所有 cDNA 克隆都应用 GC 加尾的方法来进行：将 dC 残基加到双链 cDNA 上而将互补的 dG 残基加到用 PstⅠ 消化的质粒载体上，切割后留下 3' 突出端，为同聚物加尾的理想底物。 克隆 cDNA 常见的问题？
① cDNA 第一链太短或产量太低，尽管这些问题可能出自用于 cDNA 第一链合成的任一组分，但在更多情况下，它们反映出用作模板的 mRNA 的低劣质量；②文库中 cDNA 插入片段的长度小于期望值，该问题一般归于以下两个原因 a. cDNA 第二链的合成效率不足，以致产生带缺口或带痕量 mRNA 的双链 cDNA 分子；b.小片段 DNA 污染最终的 cDNA 制剂。③ cDNA 插入片段中 NotⅠ、 SalⅠ或 EcoRⅠ 的位点数多于期望值；④ cDNA 插入片段内 EcoRⅠ 位点的出现频率低于每 4kb 出现 1 个位点，该问题归咎于双链 cDNA 内 EcoRⅠ 位点的甲基化不完全；⑤用适当限制酶消化 λ 噬菌体载体时切割不出 cDNA 片断，该问题几乎总是由于合成接头未能有效地连接到双链 cDNA 末端而造成。
如何使用 Methylase 对克隆 DNA 进行保护？此步骤有什么意义？ 在构建基因文库时，可用于接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆 DNA 先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片断回收。
经典 RACE 克隆的原理是什么？有何意义？ 在 cDNA 两端设计两对嵌套引物（ 5'-端 GSP1-GSP2 和 3'-端 QI-QO），进行两次 PCR 扩增，第一次以 GSP1 和 QO 进行特异扩增，第二次以 GSP2 和 QI 为对应引物进行扩增而获得 3' 端和 5' 端的序列。经典 RACE 的意义在于克服了 cDNA 克隆常出现的丢失末端序列的现象。 简述差别杂交的原理和基本思路？
原理：用含目的基因的细胞群体总 mRNA 和不含目的基因的细胞群体总 mRNA 作探针，都对用含目的基因的细胞群体总 mRNA 反转录的 cDNA 与载体连接构成的 cDNA 进行平行杂交，比较他们的杂交结果挑出含目的基因的克隆。思路：①两种不同的细胞群体，一种细胞群体中的目的基因正常表达，在另一细胞群体中目的基因不表达；②制备两种不同群体的总 mRNA ；③以含目的基因的 mRNA 群体构建 cDNA 文库；④两种不同群体的总 mRNA 作探针与 cDNA 文库杂交，比较杂交结果并对照原平板，选出含目的基因的克隆。 如何从原核生物中克隆复制子？
①载体的抽提（该载体无复制子或复制子被切除）及酶切；②将所需要研究的外源 DNA 进行不完全消化；③将经过不完全消化的外源 DNA 片断连接到载体的多克隆位点；④在抗性平板上能生长的质粒即为含有复制子的目标片段，可用此方法进一步将复制子定位。
苏云金芽胞杆菌的基因组大小为 5×106bp，若 p＝99％ ，平均克隆片段为 100kb ，计算构建这样一个完全的基因文库所需的克隆数。
n=ln(1-p)/ln(1-f) n:一个完全基因文库所包含的重组体克隆数 p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f:插入片断的平均大小与基因组 DNA 大小的比值 根据以上公式可得到所需要的克隆数为228 思考题问题： 基因组DNA文库有哪些类型?其相关的特点是什么？ 思考题问题：构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题？ 思考题问题： 均一化cDNA文库构建的基本原理是什么？
思考题问题： 扣除cDNA文库的基本原理是什么?主要用途是什么？ 思考题问题： 全长cDNA文库的构建的原理和基本类型是什么？ 思考题问题： 基因克隆筛选的几种方法和相关的技术特征有哪些？