西南科技大学生命科学与工程学院2006届毕业论文
蔗糖（sucrose） -----天津市科密欧化学试剂开发中心 七水硫酸镁（magnesium sulfate）-----成都化学试剂厂 磷酸氢二钾（Potassium phosphate）-----成都化学试剂厂 葡萄糖D(t)（glucose ）-----天津市科密欧化学试剂开发中心 硝酸钾 （potassium nitrate ）-----天津市科密欧化学试剂开发中心 蛋白胨502 （peptone）------成都长寿生物试剂厂 麦芽糖（maltose） -----中国医药集团上海化学试剂公司 可容性淀粉（soluble starch） -----浙江湖川市艾湖食品化工厂 乳糖（milk sugar） ------北京益利晴细化学品有限公司 尿素 （urea） ------成都化学试剂厂 氯化氨 -----成都医药分公司化学试剂厂 1.1.2 供试仪器
手提式不锈钢蒸汽消毒器，上海三审医疗器有限公司 AIRTECE型超净无菌工作台,苏州安泰空气技术有限公司产品 HZQ-F 全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子科技开发有限公司制造 THZ-C 恒温振荡器，江苏太苍市实验设备厂 THZ-C 大容量恒温振荡器，江苏太苍市实验设备厂 DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科技有限公司 PHB-4型酸度计,成都方舟科技开发公司产品
DHP-9162型 电热恒温培养箱，上海三审医疗器有限公司
LDZX-40Ⅱ型 立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海三审医疗器有限公司 电炉，北京中兴伟业仪器有限公司 YP600电子天平，上海第二天平仪器厂 1.2 供试菌种
姬松茸(Agaricus blazei Murrill)由四川省农科所提供。 1.3 培养基
1.3.1 斜面培养基
PDA斜面培养基 蔗糖1.5%,酵母粉0.3%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%, pH自然分别分装50支试管，每支4mL/支。灭菌摆斜面后，用酒精灯烘烤试管壁上的水气，然后接种，每支放两小快。放于28度DHP-9162型电热恒温培养箱培养7天，将
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母菌激活。
1.3.2 液体种子培养基
蔗糖1.5%,酵母粉0.3%,KH2PO40.1%,MgSO4﹒7H2O0.05%,pH自然 1.3.3 液体发酵培养基
蔗糖2%,酵母粉0.5%,KH2PO40.1%,MgSO4﹒7H2O0.05%，pH自然 1.3.4 种子培养
500mL三角瓶中装5颗小陶瓷子（为了更大程度的打断菌丝,有更多的菌球），干热杀菌后装入种子培养基100mL,共10瓶，湿热灭菌后接种五块0.5厘米左右的菌丝,在27℃下,170r/min的摇床上振荡培养4天左右。 1.3.5 液体发酵培养
500mL三角瓶中装10颗小玻璃珠,干热杀菌后装入液体培养基,湿热灭菌后接种液体种子在130r/min的摇床上振荡培养。 1.4 单因素实验
1.4.1 碳源实验 碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要功能有两个，一个为微生物的生长繁殖提供能源和合成菌丝所需的碳成分；二是菌丝合成目的产物提供所需的碳成分。为此选取可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、玉米。
取500mL摇瓶做菌丝体生长容器，每瓶装入100mL液体培养基，碳源实验基础培养基：酵母粉0.3%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.1%中分别添加2%的可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、玉米，pH自然，每组3瓶。
0.1MPa灭菌20min，将种子液等量接入每组培养液，放进摇床培养。摇床速度130r/min，温度为室温，培养7d。菌丝干重测定:取100mL发酵液用4层纱布过滤后,用自来水洗涤3次,然后将菌丝在60℃下烘12h称重。
1.4.2 氮源实验 氮源是组成培养基的主要成分之一，其主要功能有两个，一个为微生物的生长繁殖提供能源和合成菌丝所需的氮成分；二是菌丝合成目的产物提供所需的氮成分。
取500mL摇瓶做菌丝体生长容器，每瓶装入100mL液体培养基，在氮源实验基础培养（玉米粉2%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.1%）中分别添加0.30%的酵母膏、NH4CL、蛋白胨、KNO3、尿素、黄豆浆（打浆后用6层纱布过滤），pH自然，每组3瓶。
0.1MPa灭菌20min，将种子液等量接到每组培养液，放进摇床培养。摇床速度130r/min，温度为室温，培养7d。菌丝干重测定：取100mL发酵液用4层纱布过滤后，
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用自来水洗涤3次,然后将菌丝在60℃下烘12h称重。
1.4.3 碳氮比实验 取500mL摇瓶做菌丝体生长容器，每瓶装入100mL液体培养基，在供试基础培养基中去掉2g蛋白胨,然后添加不同重量酵母(酵母含碳量忽略不计)配成培养基,碳氮比为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1，每一处理重复5次，观察不同碳氮比对姬松茸菌丝生长的影响，pH自然，每组5瓶。
0.1MPa灭菌20min，将种子液等量接入每组培养液，放进摇床培养。摇床速度130r/min，温度为室温，培养7d。菌丝干重测定:取100mL发酵液用4层纱布过滤后,用自来水洗涤3次,然后将菌丝在60度下烘12h称重[15]。
1.4.4 温度实验 温度主要影响菌丝体新陈代谢过程中的酶活性，较低温度时，发酵时间长，菌丝体生长很慢，而温度偏高时，菌丝体容易老化，进而影响菌丝体的生长。故设计测试温度25℃、26℃、27℃、28℃、29℃。
在温度实验基础培养：玉米粉2%、酵母0.3%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.1%、麸皮2%，分成5组分，pH自然，每组3瓶。0.1MPa灭菌20min，将种子液等量接入每组培养液，放进摇床培养。摇床速度130r/min，温度为室温，培养7d。菌丝干重测定:取100mL发酵液用4层纱布过滤后,用自来水洗涤3次,然后将菌丝在60度下烘12h称重。 1.3.5 pH实验 pH值对菌丝的生长有很大影响，尤其对酶的活性，过高过过低都会在一定程度上影响抑制酶的活性，适宜的PH值促进酶的活性和生长。
在pH实验基础培养：玉米粉2%、酵母膏0.3%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.1%、麸皮2%， 分成6组分，将每组份的pH值分别调到4、5、6、7、8、9。所用的pH标准液是混合磷酸盐pH=6.84；邻苯二甲酸氢钾pH=4.003；硼酸pH=9.182，每组3瓶。
0.1MPa灭菌20min，将种子液等量接入每组培养液，放进摇床培养。摇床速度130r/min，温度为室温，培养7d。菌丝干重测定:取100mL发酵液用4层纱布过滤后,用自来水洗涤3次,然后将菌丝在60℃下烘12h称重。
1.4.6 转速实验 摇瓶转速对菌丝体的生长，如果过快，剪切力叫大，菌丝容易断，菌丝球小，不利于胞外产物的积累；转速过慢，菌丝球大，生物量少。故设计转速为90 r/min、110 r/min、130 r/min、150 r/min、170 r/min。
取250mL输液瓶做菌丝体生长容器，每瓶装入100mL液体培养基(蔗糖2%、黄豆浆0.3%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.1%、pH自然)。0.1MPa灭菌20min，将种子液等量接入培养液，放入温度为室温，转速梯度为90 r/min、110 r/min、130 r/min、150 r/min、170 r/min的六个摇床上进行培养，每个摇床3瓶，培养一周。培养完毕后将菌丝体过
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滤，放入称量瓶中， 60℃烘干12h，称重。 1.4 菌丝优化实验
为了考察单因素的协同作用,以及在液体培养时的生长利用状况,故选用玉米、黄豆饼粉、KH2PO4 、pH等4个因子,各取3个水平,在摇瓶中进行L9(34) 正交实验。
0.1MPa灭菌20min，将种子液等量接入每组培养液，放进摇床培养。摇床速度130r/min，温度为室温，培养7d。菌丝干重测定:取100mL发酵液用4层纱布过滤后,用自来水洗涤3次,然后将菌丝在60℃下烘12h称重。
2. 结果与分析
2.1 培养基
2.1.1 斜面培养基实验的试管长满洁白的菌丝，附着在试管壁上。
2.1.2 液体种子培养实验所培养的种子呈乳黄色，健壮，较密；菌球的直径大约为4～
5 mm。其中有2瓶被污染，原因大概是瓶口密封不严,箱内有细菌孢子，受细菌污染。 2.2 单因素实验
2.2.1 碳源实验 不同的碳源对姬松茸菌丝生长促进的作用不一致,实验结果见表1。
表1.碳源对姬松茸菌丝生长的影响 单位：g
碳源 可溶淀粉 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 乳糖 玉米
序号
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 0.41 0.30 0.29 0.35 0.32 0.36
0.59 0.30 0.26 0.41 0.30 0.38
0.43 0.36 0.30 0.30 0.28 0.39
平均产量 菌丝体特征 0.477
0.320 0.253 0.350 0.300 0.377
乳白、健壮 乳白、健壮 乳黄、亚健壮 乳白、健壮 乳白、健壮 乳黄、健壮
密 度 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
表1单因素方差分析结果：F=5.89，而F0.05(5，12)= 3.11，F0.01(5，12)= 5.06，则F> F0.05(5，
12)，F> F0.01(5，12)。结论：碳源对姬松茸菌丝体生长的影响极为显著。
下面对碳源实验指标趋势和实验误差的分析，处理结果见图1。
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碳源实验测定菌丝产量 单位:g/100ml0.60.50.40.30.20.101234碳源种类56
123456图1 实验因素与指标趋势
*注：1.soluble starch 2.glucose 3.ncaltose 4.sucrose 5.milk sugar 6.maize
由图1可知：姬松茸对单糖、多糖和天然农副产品均能较好利用，对可溶性淀粉、玉米利用较好，在100mL中平均生长量为0.477g和0.377g。明显要好于其他的，麦芽糖和乳糖生长很不好，作为生产经济和成本的考虑，但在本实验优化中采用了玉米作碳源。
2.2.2 氮源实验 不同的氮源对姬松茸菌丝生长促进的作用不一致,实验结果见表2。
表2：氮源对姬松茸菌丝生长的影响 单位：g
碳源 酵母膏 NH4CL 蛋白胨 KNO3 尿素 黄豆浆
序号
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 0.40 0.29 0.39 0.29 0.21 0.32
0.45 0.23 0.36 0.23 0.31 0.36
0.26 0.23 0.41 0.11 0.36 0.30
平均产量 0.370
0.250 0.388 0.210 0.323 0.323
菌丝体特征 乳黄色、健壮、 乳白色、亚健壮 乳白色、健壮 乳白色、亚健壮 乳白色、亚健壮 乳黄白、健壮
密度 * * * * * * * * * * * * * * * * * *
表2单因素方差分析结果：F=3.18，而F0.05(5，12)= 3.11，F0.01(5，12)= 5.06，则F> F0.05(5，
12)，F 下面对氮源实验指标趋势和实验误差的分析，处理结果见图2。 10