基于高通量测序的储粮害虫抗药性相关基因的转录组学分析及其技术研究
专业：食品科学 姓名：陶冶心 学号：1120140520
摘要：随着测序技术的发展，昆虫转录组数据不断积累，在昆虫学研究中的应用也越来越广泛。在害虫抗药性的研究中，转录组数据分析也是重要的最新研究手段。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。RNA-Seq作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。本文简要介绍了转录组学及其定义，并以RNA测序为例着重介绍了高通量测序在转录组中的应用，并对其中有待进一步研究的问题进行展望。 关键词 ：转录组 高通量测序 抗性
Deep Sequencing-based Transcriptome Analysis in insect
resistance research
Abstract:With the development of sequencing technology，the number of known insect transcriptome sequences has increased and transcriptome data has become more useful in entomology，including research on insect resistance．Transcriptome can research from the overall level of gene function and gene structure, revealing the specific molecular mechanism in the process of biological processes and disease. RNA-Seq,as a new kind of efficient, fast transcriptome research techniques ,is changing people's understanding of the transcriptome. Transcriptomics and its definitions are briefly introduced and pick RNA sequencing as an example, fully introduced the application of high-throughput sequencing of the transcriptome, the further research problems are discussed at the same time.
Key words: transcriptome ,High-throughput sequencing, resistance
由于杀虫剂的长期使用，昆虫产生的抗药性已成为农林虫害治理面临的重大问题研究昆虫抗药性机制有助于为农林害虫防控、资源昆虫抗性品系选育及新型杀虫剂研发提供科学指导。长期以来，人们通过对模式昆虫、卫生昆虫和农林害虫的研究，对昆虫代谢抗性、靶标抗性有了一定认识，继而利用分子生物学手段克隆、分析了一些抗性相关基因，上述研究方
案中，受限于序列获得的困难，往往只研究某一个或几个基因，并将代谢抗性和靶标抗性割裂开来分析。组学技术的出现使研究人员有可能对所有抗性相关的基因开展系统的分析。 1转录组学的发展 1.1转录组
转录组（transcriptome)广义上是指在一定生理条件下，某一物种的组织或特定细胞内 的全部转录产物的总和，包括了信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA (rRNA)和非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)。狭义上指的是细胞内能够转录出的所有mRNA分子。mRNA作为信使RNA通过编码蛋白质，负责将基因的遗传信息传递给行使生物学功能的蛋白质，被认为是DNA与蛋白质之间生物信息传递的“桥梁”[1]。 ncRNA是不被翻译成蛋白质的RNA分子，在转录产物中占的比例也较大，它们对生物体的各项生命活动具有重要的调节作用，如蛋白质合成及降解、蛋白质细胞定位、参与mRNA的稳定性及翻译、mRNA选择性剪接及降解、rRNA的甲基化修饰及假尿啼聢化加工、DNA端粒合成及细胞寿命的调控、染色体复制、染色体表观遗传修饰等[2-3]。
转录组的定义里面包括了时间与空间的限定,显著不同于基因组的固定不变（除基因突变），即同一细胞在不同的生长周期及生长环境下，其基因表达情况不完全相同[4]。 1.2 转录组学
随着当今科学技术的飞速发展，目前越来越多的物种全基因测序工作已完成，下一阶 段我们面临的主要问题就是这些基因的功能有哪些？不同的基因参与了哪些组织细胞中的基因表达的调控？参与哪些生命过程？相同的基因在不同细胞内或者疾病和治疗状态下的表达水平、以及基因与基因产物之间的相互作用等等。因此，在人类基因组测序研究后，科学家们更多的精力转移到功能基因组学的研究中。
功能基因组学（Functional Genomics）是利用结构基因组学提供的信息和产物，以高通量、大规模实验方法，应用统计科学和计算机分析，在基因组或系统水平全面研究功能基因、蛋白质和代谢物，并探索它们之间的相互联系和规律[5]。
转录组学(transcriptomics)是功能基因组学的一个重要组成部分，是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况，可以用来研究某一生理条件或时空条件下该物种转录水平和正常情况下的差异，能够将功能基因组学与RNA水平的基因表达情况的研究联系起来。因此，在人类基因组计划完成后，转录组学研究很快受到科学家的关注。目前，转录组学已经成为基因表达调控研究的重要手段，从一个细胞或组织基因组的全部mRNA 水平研究基因表达情况，它
能够提供全部基因的表达调节系统和蛋白质的功能、相互作用的信息。基因转录水平上的调控是生物最重要的调控形式，也是现在研究最多的基因表达调控形式。转录组学研究的不断深入，必将为生命科学的更多新领域的探索研究提供高效的方法。 1.3转录组研究技术的发展
转录组学研究是基于高通量的，用大规模的数据研究生命过程中一系列基因的整体水平的转录机理。因此需要先获取大量已知的基因序列信息和转录本序列，并且对所研究对象的基因组需要有一个全局性的了解。
第一个得到描述的转录组是酿酒酵母细胞，共分析了60633个转录本，揭示了4665个基因，其中，1981个基因有已知的功能，而2684个基因从未被鉴定过[6]。随着科技的进步以及转录组研究的不断加深，科学家们已经建立起来了一系列的技术方法，转录组的研究方法主要有以下几种：（1）基于杂交的转录组学方法：基因芯片(DNA microarray)；（2）基于测序的转录组学方法：主要包括：表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)[7,8]、基因表达序列分析(SerrialAnalysis of Gene Expression ， SAGE) 、大规模平行测序 (Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)；（3）基于新一代高通量测序技术(High-ThroughputSequencing)的转录组测序等等。 2基于新一代高通量技术的转录组学研究方法 2.1新一代高通量技术的测序技术的发展
新一代高通量测序技术（454GS-FLX，Solexa, SOLiD)具有高通量、高检测灵敏度以及低运行成本等优点，堪称测序技术发展历程的一个里程碑，该技术可以对数百万个DNA 分子进行同时测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此也称其为深度测序( deep sequencing) [9]。RNA-Seq技术，又称转录组测序技术，就是近几年发展起来的应用新一代高通量测序进行转录组学研究的技术[10]。原则上，所有的高通量测序技术都能够应用于RNA测序。
20世纪70年代的Sanger法测序技术是最早广泛应用的DNA测序技术[11]，它是一种以末端终止法为原理建立起来的技术。Sanger测序作为30多年来惟一的DNA测序方法，对现代生物学研究起到了极大的促进作用。测序时，DNA分子被切断为大的片段，测得大片段的序列后，继续将大片段切断成小片段，逐步测定整个基因组序列。但是，Sanger法技术测序通量低，费时费力且成本高，需要大量的技术人员参与。随着大规模基因组学的兴起，多种高通量低成本的测序技术应运而生，并逐步被应用到生物学研究的各个领域。目前, 新一代测序技术正以Sanger测序无可比拟的速度产生海量数据, 不仅引领生命科学全面进入后基因组
时代，更推动了生物信息学、系统生物学等交叉学科的迅猛发展。
循环芯片测序法（cyclic-arraysequencing)[12]为近年来出现的一种新的测序方法，也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”Next-generation Sequencing Technology)。这一技术不断得到创新和改良，在保证基因组测序足够精确的前提下，操作程序的优化，测序通量急速增加，是传统Sanger法的几百到几千倍，测试的成本也呈现直线下降的趋势，只为原有技术的几十分之一。新一代测序技术的核心思想就是边合成（或者连接）边测序[13]。
自2005年以来，以Roche公司的454技术（Roch GS FLX sequencer，以emulsion-PCR和焦磷酸测序技术为核心）、Illumina公司的Solexa技术(niumina/Solexa Genome Analyzer，核心为单分子阵列原位扩增及边合成边测序技术）和ABI公司的SOLiD技术（ABISOLiD Sequencer，以支持寡核苷酸链接及检测技术为核心）为标志的新一代或下一代测序技(next-generation sequencing techology, NST)相继出现，目前已经比较成熟和商品化，在多个领域得到了广泛应用。在这三种新一代测序平台中，Illumina/Solexa测序平台上的RNA测序技术(RNA sequencing，RNA-seq)应用最为广泛。 2.2 高通量RNA测序及其在转录组研究中的应用
高通量测序技术的迅猛发展，将基因组学水平的研究带入了一个新的时期，也使经典分子生物科学家对基因组学的认识和思考上升到一个新的水平。高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。
近年来，包括基因组、转录组、蛋白质组等的各种组学技术在功能基因发现及鉴定中起着越来越重要的作用。由于全基因组测序费用仍然很高，蛋白质组实验技术有待进一步的提高，转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是全基因组测序完成后首先要面对的问题。最近科学家们将高通量测序技术应用于转录组分析开发出了RNA测序技术( RNA-Seq)。高通量转录组测序避免了克隆亚克隆过程中引入的偏差，且其确定的序列长度显著增加，提高了识别其对应基因的准确性。同时，计算这些短序列的个数和分析其在整个基因组中的分布，可以计算出转录组表达水平。已经广泛应用于细菌、拟南芥、水稻和人类等生物转录组的研究。我国在应用RNA-Seq 进行水稻转录谱分析方面走在了世界的前列。王俊和韩斌领导的研究小组利用RNA-Seq 技术分别对水稻的转录组进行高分辨率的分析，发现水稻具有可变剪切模式基因数目远远高于预期[14-15]。
RNA-Seq即对细胞转录产物进行测序，统计测得的每条序列获得每个特定转录本的表达量，可提供精确的数字化表达谱检测。该技术首先将细胞中的所有转录产物反转录为cDNA
文库，然后将cDNA 文库中的DNA随机剪切为小片段(片段大小根据采取的测序方法的读长而不同)，利用新一代高通量测序仪测序直到获得足够的序列。高通量测序避免了亚克隆过程中引入的偏差，且其确定的短序列长度显著增加。获得长度显著增加的短序列所包含信息可以提高识别其对应的基因的准确性，然后计算这些短序列的个数和分析其在整个基因组中的分布，可以计算出细胞的转录组表达水[16]。RNA-Seq技术具有十分广泛的应用领域： （1）检测新的转录本：Zhang[17] 等运用RNA高通量双向深度测序技术，首次展现了水稻8个组织部位的转录本表达图谱全貌，并且能够精确检测到丰度非常低的转录产物，获得相当可观数量的全新转录本。
（2）基因转录水平研究，如基因表达量、不同样本间差异表达:通过分析不同处理、不同条件下、不同组织间的基因表达差异性，可以将那些显著差异表达的基因与某些生物学功能关联起来，从而为深入研究昆虫体内相关的分子生物学机制奠定基础。李新建在其博士论文中比较了荣昌猪和长白猪的转录本，筛选出1596个差异表达显著的基因[18]。分别对褐飞虱和稻纵卷叶螟的不同发育阶段建库并进行RNA-Seq 测序，进行差异表达分析，获得了大量与发育阶段相关且具有显著表达差异的基因，这些成果为害虫防治研究提供了重要的参考[19]。 （3）基因功能注释。将所测reads与已有数据库（如GO、KEGG）已注释功能的基因相比对分析，从而揭示特定转录状态下的基因的功能和生物通路等。AjaiK等采用454测序平台对牛角癌组织和正常角组织转录本分析，并对909345个转录本进行了GO和KEGG分析[20]。 (4) 转录本结构变异研究，如可变剪接、RNA编辑、基因融合等。转录本结构的变异能揭示基因转录后表达的多样性。可变剪接使一个基因产生多个mRNA转录本，从而翻译成不同的蛋白。早在2004年，家蚕就完成了基因组测序工作，2012年利用RNA-Seq数据纠正了1140个已知的基因结构，发现了几千个新的可变剪接[21]。基因融合是最近利用转录组高通量测序研究的一个新的内容，主要在肿瘤组织中发现。Shancheng Ren等对14个中国汉族人的原发性前列腺癌和他们的正常组织进行RNA-Seq分析，揭示前列腺癌的基因融合、长非编码RNA、可变剪切和体细胞突变的多样性[22]。
(5) 开发SNPs和SSR等。通过比对转录本和参考基因组间的序列，寻找潜在的SNPs或SSRs。Stephen B等对HapMap中60个欧洲后代进行了转录组测序分析，开发了901个人基因组上的cSNP（编码SNP）。Angela Ca’novas等对荷斯坦奶牛乳样品进行转录组分析，开发了33045个具有多态性的cSNPs[20]。 2.3 面临的挑战
随着测序技术的不断进步, 我们能够对转录组开展更为深入的测序工作, 能够发现更多、