更可靠的转录子, 目前的大规模并行测序技术已经彻底改变了我们对转录组的研究方法，测序结果的质量也在不断提高，得到的信息量也在爆炸式增长。然而和其他所有新生技术一样，RNA-Seq 技术也面临着一系列新问题：其一是庞大的数据量所带来的信息学难题，比如如何最好地诠释和比对鉴定多个类似的同源基因，如何确定最佳测序量，获得高质量的转录图谱等[16]；其二是如何针对更复杂的转录组来识别和追踪所有基因中罕见RNA亚型的表达变化。有可能提前实现这一目标的将是使用配对末端测序和单分子测序等更新的测序技术，以及使用更长的读段来增加测序深度和覆盖度[23]；其三，目前的高通量测序技术大都需要较多的样品起始量, 这使得来源极为有限的生物样品分析受到限制, 因此如何对单细胞或少量细胞进行转录组测序是一个亟待解决的问题。最近这方面的研究也取得了一定进展，如Tang 等[24]建立了一种mRNA-Seq方案，它以PCR为基础扩增单个细胞的mRNA转录组，成功分析了取自小鼠四细胞胚胎时期的单个卵裂球的转录组。然而该方法只能捕捉带有poly(A)尾巴的mRNA，也不能检测绝大多数较长的mRNA(大于3 kb)的5′末端, 同时也不能保留原转录子的方向信息。除此之外还有一些新的针对低数量细胞进行转录组研究的技术正在不断被开发
[25]
。最后，标准的RNA-Seq 技术不能提供序列转录的方向信息，而这对于转录组注释尤为
重要, 采用single-strand sequencing和strandspecific sequencing技术能很好的解决这一问题,或将成为RNA-Seq 技术发展的一个重要方向。 3 展望
RNA-Seq 为转录组学研究提供了一个很好的契机，不仅提供了转录组序列的全貌，而且提供了基因表达信息，正逐步成为昆虫分子生物学研究的主要工具。美国科学家发起了ik5 计划，拟开展5000种昆虫的基因组测序项目，丰富昆虫基因资源。但由于基因组测序成本高，昆虫种类繁多，RNA-Seq仍然是获取基因资源的主要方式。随着RNA-Seq技术进一步发展，其测序读长和测序准确性将会得到改善，可以更深入具体地研究昆虫的各种复杂生命现象，对害虫防治和资源昆虫利用起到重要的推动作用。此外，由于RNA-Seq数据分析工具和产生的数据特征紧密相关，因此在RNA-Seq技术不断成熟并被广泛应用时，需要更多针对昆虫基因数据进行优化的分析软件，将给生物信息学研究者提供广阔的空间[26~27]。 参考文献
[1] CostaV, Angelini C, De feis I，Ciccodicola A. Uncovering the Complexity of Transcriptomes with RNA-Seq[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology,2010，10:1-20.
[2] 王康宇，王义，孙春玉，等.ＲNA测序的研究进展[J].江苏农业科学，2014，42(10):12 － 16．
[3]王金花，郜海燕，许晴晴，等．转录组学在果蔬采后衰老生物学的中的研究进展［J］．浙江农业科学，2014 (7):1067－1072
[4] Lander, E.S.，Consortium, I.H.GS., Linton, L.M., Birren, B.,Nusbaum, C., Zody, M.C.,Baldwin, J., Devon, K.，Dewar, K., Doyle, M., et al (2001). Initial sequencing andanalysis of the human genome. Nature 409，860-921.
[5]贾琪，吴名耀，梁康迳，等.基因组学在作物抗逆性研究中的新进展[J].中国生态农业学报, Apr. 2014, 22(4): 375
385.
[6] Velculescu VE, Zhang L, Zhou W, et al. Characterization of the yeast transcriptome. Cell, 1997, 88∶243~251.
[7] 张棋麟，袁明龙.基于新一代测序技术的昆虫转录组学研究进展[J].昆虫学报,2013，56( 12): 1489－1508
[8]吴春颖，宋经元，陈士林. 表达序列标签在药用植物研究中的应用[J].中草药, 2008,39(5):778-782.
[9]高静,焦雅,张文广.高通量测序序列比对研究综述[J].生命科学研究,2014,18(5):458~464. [10] 冯超,朱长青,徐昌杰,等.RNA-Seq在果树学研究中的应用[J].果树学报2014,3,11:115～124.
[11] Sanger F, Nicklen S, Coulson A R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1977, 74(12): 5463-5467.
[12]乔鑫，李梦，殷豪，等.果树全基因组测序研究进展.园艺学报,2014,41(1):165–177. [13] Shendure J, Mitra R D, Varma C, et al. Advanced sequencing technologies: methods and goals[J]. Nature Reviews Genetics, 2004, 5(5): 335-344.
[14]许波，张伟强，冯晓曦,等.转录组测序技术在玉米中的应用研究进展[J].玉米科学，2014，22(1)：67 ~72.
[15] Zhang G, Guo G, Hu X, et al. Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome[J]. Genome research, 2010, 20(5): 646-654.
[16]兰道亮,熊显荣,位艳丽，等.基于RNA-Seq高通量测序技术的牦牛卵巢转录组研究[J].《中国科学》杂志社,2014,44(3):307 ~ 317.
[17]潘嵩，陈岩，朱水芳,等.高通量测序技术及其在检验检疫中的应用展望[J].中国检验检疫科学研究院，2014,5.
[18] 李新建．猪脂肪沉积关键基因筛选及TCTP基因功能研究［Ｃ］．陕西：西北农林科
技大学，2011．
[19] Daines B, Wang H, Wang L, et al. The Drosophila melanogaster transcriptome by paired-end RNA sequencing[J]. Genome research, 2011, 21(2): 315-324.
[20]周家蓬，裴智勇，陈禹保，等[J]. 基于高通量测序的全基因组关联研究策略, 2014, 36(11): 1099―1111
[21] 刘金定, 张赞, 黄水清, 等. 昆虫 RNA-Seq 数据的分析流程[J]. 应用昆虫学报, 2013, 50(5): 1458-1468.
[22] Ren S, Peng Z, Mao J H, et al. RNA-seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifies recurrent gene fusions, cancer-associated long noncoding RNAs and aberrant alternative splicings[J]. Cell research, 2012, 22(5): 806-821.
[23]刘玉林,李伟,张志翔,等.基于高通量测序的辽东栎转录组学研究[J].生物技术通报,2014,7. [24] Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell[J]. Nature methods, 2009, 6(5): 377-382.
[25] Ozsolak F, Milos P M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities[J]. Nature reviews genetics, 2011, 12(2): 87-98.
[26]宋作伟,黄茉莉,薛仁宇,等.基于RNA-Seq技术检测分析家蚕卵巢发育高表达基因[J].蚕业科学，2013，39( 4) : 0663－0673.
[27]刘金定,张赞,黄水清,等.昆虫ＲNA-Seq数据的分析流程[J].应用昆虫学报,2013，50( 5) :1458－1468．