酶的固定化与化学修饰技术
08-生物工程（中外）-2班
刘洋 前言
固定化技术的应用可追溯到20世纪50年代，人们通过有目的地将酶包裹于聚合物基质或连接于载体分子而限制酶的移动。固定化酶是20世纪50年代开始发展起来的一项新技术，最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以通过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍处于溶解状态只不过被固定在一个有限的空间内不能在自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不恰当了。在1971年第一届国际酶工程会议上，建议正式采用“固定化酶”的名称[1]。
所以固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态的酶，都应该满足上述固
定化酶的条件。例如，将一种不能透过高分子化合物的半透膜置入容器内，并加入酶及高分子底物，使之进行酶反应，低分子生成物就会连续不断地透过滤膜而被回收再利用，这种酶实质也是一种固化酶。
此外化学修饰与酶的固定化也有紧密的联系，总结化学修饰的作用，以
下几点：1探测蛋白质必需基团的性质和数目○2用于蛋白质纯度鉴定○3用于蛋白○质一级结构的测定○4用于蛋白质分子构象变化及运动性○5利用亲和标记探测活性部位局部构象变化○6利用交联反应研究寡聚蛋白质亚基之间的排列及受体与激素的相互作用○7蛋白质单晶的同晶置换：X－晶体衍射○8固定化酶○9改造蛋白质的性质
I酶的固定化
一、酶的固定方法
酶的固定方法有五种，分别为：吸附法、包埋法、共价键结合法、肽键
结合法和交联法[4]。
1、吸附法：吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少，但酶附着在载体上，易于脱落，很少实用价值。离子吸附法是将酶与含有离子交换基的水不溶性载体相结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上用途颇广。
2、包埋法：包埋法是将包埋于格子内，这格子的结构可以防止蛋白质渗出
于周围培养基中，但是底物仍能渗入这格子内与酶相接触。这个方法的优点，是酶分子本身不参加水不溶性格子的形成，许多种酶都可以用此法固定化。此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学反应，固可得到活力较高的固定化酶，但是此法对作用于大分子底物是不适用的。
3、共价键结合法：共价键结合法是将酶与聚合物载体共价键结合的固定化方法，此方法研究较为深入。与载体共价结合的酶的功能基团，包括（1）氨基：赖氨酸的氨基和多肽键的N末端的α-NH2基，（2）羧基：天门冬氨酸的β-羧基，谷氨酸的α-羧基和末端α-羧基，（3）酚基：酪氨酸的酚环，（4羧基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羧基，（5）咪唑基：组氨酸的咪唑基，（6）吲哚基：色氨酸的吲哚基。实际上，最常见的共价键结合反应包括氨基、羧基或酪氨酸和组氨酸的芳环。
此法的优点，是酶与载体的结合较为牢固，酶不易脱落，但因反应条件较为剧烈，酶活不免损失，且制备手续亦复杂。
4、肽键结合法：这是在酶蛋白和水不溶性载体间形成肽键的方法。主要是将含羧基的水不溶性载体转变为酰基迭氮、氯化物
异氰酸盐等的反应性衍生物，再把这些衍生物与酶的游离氨基相反应，而形成肽键。
5、交联法：这是使用双功能或多功能的试剂与酶分子之间进行的分子间的交联的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、旈基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶显著失活。酶的交联试剂有许多种，最常用的是戊二醛[4]。
二、固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1酶的稳定性得到改进； ○
2具专择性用途的催化剂可以“缝制”； ○
3酶可以再生利用； ○
4连续化操作可得以实践； ○
5反应所需的空间小； ○
6反应的最优化控制成为可能； ○
7可得到高纯度、高质量的产品； ○
8资源方便、减少污染。 ○
三、固定化酶的性质
酶经固定化以后，由于受到载体等因素的影响，其特征可能会发生某些改变。为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别，
并对操作条件加以适当调整。
1、稳定性 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现在对热、蛋白酶、各种变性剂的耐受性增强，使用和保存的稳定性提高。
2、最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但也有些固定化酶的最适温度与游离酶比较有明显的差别。例如，氨基酸酰化酶最适温度一般在60 ℃左右，用DEAE-纤维素固定化后，其最适温度高达72 ℃。
3、最适pH 酶经固定化后，其最适pH往往会发生变化，这一点在使用时必须引起注意。影响固定化酶最适pH因素主要有两个：一个是载体的带电性质；另一个是酶催化反应的产物性质。
载体的带电性质对固定化酶的最适pH也有明显的影响。一般说来，带负电的载体制备固定化酶，其最适pH比游离酶高；而带正电的载体制备的固定化酶其最适pH比游离酶低；而用电中性的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。
酶催化反应的产物性质对固定化酶的最适pH也有一定的影响。一般来说，产物为酸性时固定化酶的最适pH比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低一些，产物为中性时，最适pH一般不改变。
4、底物特异性 固定化酶的底物特异性与游离酶比较有所不同。比如对一些可作用于大分子底物，也可作用于小分子底物的酶而言，经固定化后，由于受到载体空间位阻作用的影响，大分子底物难于接近酶分子，而使其催化反应速度大大降低，而小分子底物的反应速度则不受影响[1]。 四、固定化酶在食品工业中的应用
自1953年N·Grubhofer用共价偶联法，在载体聚氨基聚苯乙烯树脂上连接了淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶与核糖核酸酶，获得首批固定化酶之后，经多年实线，运用各种各样的方法，现已制备出数百种固定化酶。如生产中使用规模最大的固定化酶是在DEAE?葡聚糖凝胶上固定的氨基酸酰化酶。该酶水解N?酰基?L?氨基酸中的酰胺键，对于N?酰基?D?氨基酸无作用，故可用来拆分DL?氨基酸，制备L?氨基酸。
在食品工业中，可把固定化的?-淀粉酶与葡萄糖淀粉酶混合装柱，糊化的淀粉溶液流经此柱后，淀粉便水解为葡萄糖，这是近几年提出的酶法制葡萄糖的一条新途径。近几年来，不少地方采用过氧化氢对牛奶灭菌，为了除去牛奶中过量的过氧化氢，可用固定化的过氧化氢酶使之分解。此外，还有人介绍固定化的葡萄糖氧化酶清除蛋清中微量的葡萄糖，以防制成的蛋白干片在贮存中发生褐变。
固定化酶在食品工业上还有以下几方面的应用：如用固定化果胶酶澄清果汁；用固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒；用固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖等。一旦固定化酶大规模用于食品工业，必将有助于更经济更有效地生产高质量的食品。
II化学修饰技术
一、化学修饰技术定义
通过添加或去除蛋白质或核酸等分子上的某些功能基团而改变酶、蛋白质或基因活性的过程。 二、酶的化学修饰原因 1、稳定性
2、酶反应的最适条件 3、酶的专一性 4、米式常数过大 5、临床应用的特殊要求 6、酶种类的限制 三、酶化学修饰的基本原理
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂
大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
A、大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B、酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性
酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除。“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 5、酶微环境稳定的维持 pH值改变时：
1破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力 。 ○
2改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态和它们之间的相互结合及作用方式。○
许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形一层“缓冲外壳”[1]。
四、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用
1、生物技术领域：改变酶的最适pH、改变酶底物专一性、有机溶剂可溶解酶、提高酶耐热、酸、碱的能力
2、理论研究：酶中特定基团之间距离、氨基酸残基的存在状态、酶的大小形状和构象、确定酶活性部位、氨基酸数量顺序测定
3、医药：解除医用酶免疫源性和抗原性、提高医用酶稳定性、延长医用酶体内半衰期
III参考文献
[1] 储炬,李友荣.《现代生物工艺学（上册）》.
[2] 陈坚、李寅.《发酵过程优化原理与实践》.化学工业出版社. 2002 [3] (日)山根恒夫. 周斌（译）《生化反应工程》.西北大学出版社.1992 [4] 陈騊声、居乃琥、陈石根.《固定化理论与应用》.轻工业出版社.1987