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细胞周期负反馈调控通路的研究进展
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：袁晓华 张焕铃 刘福英 【关键词】 ARF;INK4a;RB ;E2F1
1 P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53的相互制约关系 鼠双微体(MDM2)基因,最初由Donna Geroge及其合作者在自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来。 MDM2具有在细胞核和细胞质之间穿梭的功能,人类的MDM2定位于染色体12q1314，MDM2的(1)区内具有核定位(NLS)与核输出(NES)序列，利用其NLS序列与细胞核内的P53相结合,然后利用其NES信号,将P53运到胞浆,再通过其自身的E3泛素连接酶活性,使P53蛋白泛素化而降解。然而P53的活化又能促进MDM2的转录，这样就在P53与MDM2之间形成一个负反馈环，这对于维持MDM2与P53之间的平衡非常重要。最近研究发现的一种小分子物质Nutline，是顺式咪唑啉的衍生物，可以抑制MDM2的功能。Nutline可以通过细胞膜进入细胞内，从MDM2的P53结合域的疏水口袋里将P53替换出来〔1〕。 人类基因P16(INK4A)位于染色体9p21，由于mRNA的不同剪
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切，其编码的基因产物有两种，即P16INK4A和P19ARF,外显子1β通过剪切与外显子2 、3相连形成了P19ARF的mRNA,而P16INK4A选择了外显子1α和外显子2 、3,做为其mRNA的拼接方式，两种产物共享外显子2和3,外显子1α和1β分别由各自独立的启动子启动。P19ARF能通过与MDM2相结合，加速MDM2的降解，从而稳定P53蛋白，使P53积累。而P16INK4A同周期蛋白D竞争性的与细胞周期素依赖性激酶(CDK)结合，抑制cyclinDCDK4/6的活性。 正常情况下，视网膜母细胞瘤蛋白(RB)存在于整个细胞周期中，它能与许多转录调控因子结合，它的结合能力受自身磷酸化状态的限制，只有非磷酸化的RB才具有抑制细胞增殖的活性，具有G1→S、G2→M期的细胞阻滞活性。非磷酸化的RB和E2F结合，抑制细胞的转录。而cyclinDCDK可使RB磷酸化导致RBE2F解离，释放E2F，E2F参与基因的转录,协助细胞通过G1期。P16INK4A同周期蛋白D竞争性的与CDK结合，抑制cyclinDCDK4/6的活性，从而抑制RB的磷酸化，使RBE2F复合物发挥其抑制转录的活性。 P21cip1与P27kip1都是周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白，可以与cyclinCDK复合物结合。cyclinD在G1期早期表达，跨越整个G1期;而cyclineE在G1期末表达，在G1/S交界处急剧升高达高峰。P21cip1与P27kip1和cyclinDCDK4/6结合则稳定并激活cyclinDCDK4/6〔2〕，P21cip1与P27kip1与cyclineECDK2结合则会抑制cyclineECDK2的活性，cyclineECDK2是G1/S相转换调控的汇合点，如果P21cip1和P27kip1被cyclinDCDK4/6捕获，使得
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cyclineECDK2的活性得到释放，cyclineECDK2进一步磷酸化RB，释放E2F，细胞进入S期。P16INK4A可以通过破坏cyclineDCDK的复合物，释放P21CIP1和P27KIP1,抑制cyclineECDK2，进而抑制了RB的磷酸化。所以说P16INK4A是间接抑制cyclineECDK2的活性〔2，3〕。如果没有P21cip1或P27kip1就不能体现出P16INK4A的活性。P21cip1和P27kip1基因敲除鼠的成纤维细胞cyclineD1CDK4复合物的水平下降，人为的提高CDK2的活性，仍然不能对P16INK4A所诱导的细胞周期阻滞产生应答〔2，3〕。所以说RBE2F将P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53这两条通路联系在一起〔2，4〕。P53所诱导的蛋白P21CIP1能够抑制cyclinECDK2的活性，使RB保持非磷酸化状态，与转录延长因子E2F相结合，发挥其细胞周期阻滞的作用。如果P53的活性降低，不能有效诱导P21CIP和P27CIP的表达，恢复E2F的活性，那么细胞周期就会绕过P16INK4A诱导的细胞周期阻滞这条通路〔4〕，RB失去活性释放E2F，可以诱导P53的表达，但是保持RB与E2F的结合，来抑制E2F的活性，是P19ARF和P53所介导的细胞周期阻滞所必需的。如果细胞RB基因家族全部缺失，将会对P19ARF的诱导凋亡作用产生抵抗〔5，6〕。
P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53这两条履行细胞增殖调控的通路是相辅相成缺一不可的，任何一条通路的阻滞，都能让细胞的周期出现紊乱。 2 E2F诱导凋亡的通路
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最近研究发现，E2F1的过表达可以诱导凋亡，E2F/的小鼠，表现胸腺细胞过多，这可能与未成熟前生长素应答因子(ARF)和P53的功能不能得到有效诱导有关。然而这种现象同样发生在已经衰老的E2F/小鼠，说明E2F1可以促进肿瘤细胞的凋亡〔7～9〕。前面提到Nutlin可以抑制MDM2的功能，在那些没有发生P53突变的癌细胞中，可以利用Nutline来解除MDM2对P53的抑制作用，恢复P53的转录激活作用。然而研究发现在P53缺失的结肠癌细胞(HCT116)中，这种小分子物质仍然能在某种程度上诱导凋亡。这种凋亡是依赖于E2F1所诱导的凋亡〔10〕。事实上MDM2也存在非依赖P53的途径，它可以和许多蛋白相结合，包括P14ARF、pRb、P73、E2F1/DP1等〔10〕。MDM2与E2F1/DP 的结合可以刺激E2F的转录激活作用。Nutline与MDM2的结合可以抑制MDM2与E2F1的结合，使E2F1得到释放，在DNA损伤的情况下来诱导前凋亡基因P73α、NOXA的表达，进而诱导凋亡〔11〕。E2F1可以和ARF的启动子特异性结合，诱导ARF表达，来增强P19ARFMDM2P53通路的细胞周期阻滞的功能。E2F1可以诱导P53凋亡刺激蛋白(ASPPS)的表达，ASPPS是P53的辅助因子可以增强P53的转录激活作用〔12，13〕。E2F1可以协同P53来诱导前凋亡基因的表达如：PERP 、SIVA、APAF、具有(BH3)同源结构域蛋白、PUMA、NOXA 。E2F1 还可以诱导P73的表达，以一种非依赖P53的机制来诱导凋亡。 DNA受损伤后，E2F的表达量增高，可以激活ATM/ATR，chk1和chk2使E2F1的N末端结构域磷酸化，这样避免了E2F1被泛素
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化而降解，然而这种磷酸化同样发生在C末端的364位丝氨酸位点，这两种磷酸化综合起来，对E2F1稳定性的影响还不能确定。但能确定的是E2F1的诱导凋亡的作用增强了，ATM/ATR可以进一步磷酸化P53,稳定P53四聚体的结构，促进P53发挥诱导凋亡的作用〔14〕。 在DNA 受损伤以后，E2F被乙酰化，乙酰化可以稳定E2F1，同时刺激它的转录激活作用，有趣的是，P/CAF导致的E2F1的乙酰化可以增加E2F1对靶基因的选择性。尤其是其对前凋亡基因的选择如P73、APAF1。E2F1的过表达促进P53的磷酸化和稳定，这种效应不依赖ARF〔15〕。
可能E2F过表达本身就促进DNA损伤，通过诱导无节制的DNA复制来实现DNA的损伤，这与Hemann提出的假说〔16〕看法一致，也就是癌基因所诱导的增殖可以导致DNA损伤和细胞老化两种结果。
Hallstorm与Nevins鉴定出Jab1蛋白可以和E2F1相互作用来增强其诱导凋亡的作用，而Jab1并不增加E2F1所介导的促进细胞增殖的作用〔17〕。研究发现抗凋亡蛋白Api5,它可以抑制E2F1所介导的凋亡，但它不影响E2F1所介导的转录，目前其作用机制还不清楚〔18〕。
3 ARF的非依赖P53的调控通路
ARF也有不依赖P53抗细胞增殖功能。MDM2、ARF、P53三种基因都缺失的小鼠比单独缺失ARF 或P53的小鼠发生的肿瘤种类和数目要多。这种三种基因都缺失的小鼠肿瘤发生的速度快，而且