实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法
目的要求
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。
2．未知蛋白质溶液。
三、器材
试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。
操作方法
一、标准法制定标准曲线
取14支试管，分两组按下表a平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 表a 试管编号 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝试剂/ml A595nm 二、微量法制定标准曲线
取12支试管，分两组按下表b平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
表b 试管编号 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝试剂/ml A595nm
三、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。
0 0 0.1 1 0.01 0.09 2 0.02 0.08 5ml 3 0.03 0.07 4 0.04 0.06 5 0.05 0.05 0 0 0.1 1 0.01 0.09 2 0.02 0.08 3 0.03 0.07 5ml 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色 4 0.04 0.06 5 0.05 0.05 6 0.06 0.04 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色 注意事项
（1） （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（2） （2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题：
根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：
（1） （1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。 （2） （2） 要求在半天内测定60个样品。
（3） 要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。
实验三、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
目的要求
1、学会蛋白质含量的测定方法。
2、掌握该测定方法的基本原理和优缺点。
原理
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1 h左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5?g/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10-100?g蛋白质，微量测定法测定范围是1-10?g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、乙酸、?-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如Triton X-100，SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。
试剂和器材
1试剂
(1)标准蛋白质溶液
1%OD1cm=6.6测定蛋白质结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白
含量，再用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL，0.1 mg/mL蛋白溶液。
(2)考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸。
2.待测样品
未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为0.1-5 mg/mL，若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl溶液适当稀释。
3．器材
(1)722型分光光度计 (2)微量进样器
(3)移液管(0.1 mL及5 mL) (4)试管及试管架
3．操作方法
1．标准法制作标准曲线
取14支试管，分两组按下表平行操作。 试管编号 标准蛋白含量(?g) 1 mg/mL标准 蛋白溶液(mL) 0.15mol/LNaCl (mL) 考马斯亮蓝试剂(mL) 0.10 0.09 5 mL 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0 0 0 1 10 0.01 2 20 0.02 3 30 0.03 4 40 0.04 5 50 0.05 6 60 0.06 摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 OD595nm 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2．微量法制作标准曲线
取12支试管，分两组按下表平行操作。
试管篇号 标准蛋白含量(?g) 0.1 mg/mL标准蛋白溶液(mL) 0.15 mol/L NaCl(mL) 考马斯亮蓝试剂(mL) 0.10 0.09 0 0 0 1 1 0.01 2 3 0.03 0.07 3 5 0.05 0.05 4 7 0.07 0.03 5 9 0.09 0.01 1 mL 摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595 nm处比色 OD595nm 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 3．未知样品蛋白质浓度的测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
4．注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以再试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题
1. 请详究考马斯亮蓝与蛋白质的呈色原理。如何进行蛋白质的定量测定。
2. 采用该法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？作为标准蛋
白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。
3. 使用分光光度计时，比色皿对所测样品的结果有无影响，该怎样处理？
1. 常规染色脱色方法：
a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，
则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。
注：脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。
e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。
注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。
f. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。
a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。
b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
注：脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。
2. 快速染色脱色方法：
e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。
h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。