球菌 （葡萄球菌, 链球菌）
杆菌（大肠杆菌） 弧菌（霍乱弧菌）
细菌染色法:革兰氏染色 （葡萄球菌、大肠杆菌）
3.细菌的基本形态观察球菌（葡萄球菌）球菌（链球菌）
弧菌（霍乱弧菌）杆菌（大肠杆菌）
革兰染色
1. 制片 2. 初染 3. 媒染 4. 脱色 5. 复染 6. 镜检 Notes:
乙醇脱色时间是关键环节:
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌； 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 脱色时间一般为3-5s左右。
注意：使用完酒精灯后，请随时将酒精灯火焰扑灭！！Gram stain 革兰染色葡萄球菌方法：干燥、固定标本初染（结晶紫1-3分钟）流水冲洗流水冲洗大肠杆菌媒染（卢戈氏碘液30—60秒脱色（95%酒精流水冲洗3—5秒）复染（沙黄90秒）流水冲洗油镜镜检革兰染色原理 1细胞壁结构 G+：细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少 阳性positive（紫兰色）阴性negative（红色）作业：（绘图）1.球菌（葡萄球菌,链球菌）杆菌（大肠杆菌）弧菌（霍乱弧菌）2.记录革兰染色的实验原理和步骤 G-：细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖等含有大量的脂质 2. 等电点
3. 细胞内含核糖核酸镁盐
细菌形态观察：肉毒梭菌 (革兰氏染色)、 产气荚膜
梭菌(荚膜染色)、淋球菌(革兰氏染色)、 白喉杆(奈瑟氏染色） 物理消毒与灭菌：紫外线对细菌的作用
细菌耐药性检测与机制探讨 细菌对抗生素敏感性试验 致病性球菌的分离培养与鉴定（2） 抗“O”试验 肠道菌的分离与鉴定：双糖铁培养基接种及初步鉴定
1.Check morphology of bacteria Glass Slide Demonstration示教玻片肉毒梭菌（革兰氏染色）油镜下观察：为G+粗短杆菌，芽胞椭圆形，大于菌体，位于次极端，使菌体呈网球拍状。淋球菌（革兰氏染色）油镜下观察：肾形或豆形G-双球菌，两菌的接触面较平坦或略向内陷。
细菌染色法2——奈瑟氏染色（白喉杆菌的异染颗粒）【方法】1、细菌涂片、干燥和固定。2、临用时将第一液10ml与第二液5ml相混合，将此混合液加入已固定的细菌涂片上，染1~2分钟，水洗；3、以第三液复染30秒~1分钟，水洗，待干；4、油镜镜检。【结果】菌体呈黄褐色，极体呈兰紫色。
紫外线对细菌的作用
产气荚膜梭菌（荚膜染色）油镜下观察：为G+粗大杆菌，菌体稍短，两端钝圆，单个或成双存在，外围有一圈透明荚膜。白喉杆菌:
原理
紫外线使DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶以共价键结合形成二聚体，干扰DNA的复制及转录，导致细菌的变异或死亡。紫外线的穿透力低
细菌对抗生素敏感性试验 结果
无抑菌圈——不敏感 抑菌圈为10mm——低度敏感 抑菌圈为10-20mm——中度敏感 抑菌圈>20mm——高度敏感 实验结果实验结果 4、细菌的血清学实验2 抗“O”试验血凝板孔号病人血清1:400磷酸盐缓冲液（PH6.5）还原溶血素“O”2%兔红细胞悬液个人操作30.10.10.1原理：?A族乙型链球菌产生的溶血素“O”，在还原状态下有溶血作用。它是溶血性链球菌的代谢产物之一，是一种含-SH基的蛋白质，能溶解红细胞，溶血素“O”的溶血力不稳定，易因氧化而失去活力，在还原剂的作用下可以使其重新激活而恢复其溶血力。?溶血素“O”具有很强的抗原性，能和血清内相应的抗体结合，人受溶血性链球菌感染后2—3周就能产生抗体，即抗链球菌溶血素“O”抗体。此种能中和溶血素“O”的抗体，直到病愈后数月至余年才消失。?因此，当血清内这种抗体效价显著增高时，表示机体近期曾受溶血性链球菌感染或反复溶血性链球菌侵害，比如风湿热，急性肾小球炎等。1 0.2___0.120.150.050.1摇匀后放37℃水浴箱15分钟0.10.10.1摇匀后放37℃水浴箱45分钟抗体单位4000533800 双糖铁培养基原理：不同的肠道细菌对同一种糖的分解能力不同，非致病性的肠道杆菌能分解乳糖及葡萄糖；致病性的肠道杆菌不能分解乳糖。根据这一特点，将葡萄糖和乳糖按一定的比例（1：10）配制成双糖培养基，并在培养基中加入1%酚红酒精溶液。将肠道细菌接种至该培养基中，根据培养后结果初步鉴定肠道致病菌与非致病菌。作业：1、绘图：肉毒杆菌(革兰氏染色)、产气荚膜杆菌（荚膜染色）、淋球菌(革兰氏染色)、白喉杆菌（奈瑟氏染色）2、紫外线对细菌的作用3.记录实验结果：细菌对抗生素敏感性试验、双糖铁试验4.记录抗O实验结果和诊断葡萄糖：乳糖1:10 1%酚红酒精 A：非致病菌B：致病菌
Capsule荚膜（Streptococcus pneumoniae肺炎球菌） Flagellum鞭毛（Salmonella typhi伤寒沙门菌） Spore芽胞（Clostridium tetani破伤风梭菌） Pilus菌毛
4.Widal test肥达试验 肠道菌SS平板划线分离
Capsule荚膜（Streptococcuspneumoniae肺炎球菌）Pilus菌毛金黄色葡萄球菌Staphpylococcus aureuson blood agar plates1:10病人血1-8各加生理盐水200微升清200微升200微升生理盐水对照12345678第医二学1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280次微1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560弃去200微升实生验物I伤寒杆菌的O抗原学II伤寒杆菌的H抗原各200微升轻轻摇匀III甲型副伤寒杆菌的H抗原IV乙型副伤寒杆菌的H抗原37度，45-60分钟 双毛菌
Flagellum鞭毛（Salmonellatyphi伤寒沙门菌）Spore芽胞（Clostridiumtetani破伤风梭菌）表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidison blood agar plates
肥达试验
试验步骤：1、取清洁的血凝板两块，两块血凝板分别取16孔，分成4组，每8孔为一组，在32孔中均加入生理盐水200微升。2、在每一组的第一孔中加入病人血清200微升，混匀；3、对倍稀释：用微量移液器吸200微升液体到第二孔对倍稀释，依次对倍稀释至第七孔，再从第七孔中移走200微升混合液体仍到废物缸中，第八孔对照。4、在第一组的8孔中加入伤寒杆菌的O抗原200微升，用相同的办法分别在第二组、第三组、第四组的液体中加入伤寒H抗原以及副伤寒甲、已的H抗原；5、加完抗原后，轻轻摇匀血凝板，将其放入45度的温箱中约45分钟。6、取出血凝板，观察结果，记录凝集价，并做出判断作业：（绘图）Capsule荚膜（Streptococcus pneumoniae肺炎球菌）Flagellum鞭毛（Salmonella typhi伤寒沙门菌）Spore芽胞（Clostridium tetani破伤风梭菌）记录肠道菌SS平板划线分离的实验原理和步骤记录肥达试验的实验原理和步骤
Treponema (Fontana镀银染色法)梅毒螺旋体
Leptospira (Fontana镀银染色法)钩端螺旋体 记录肠道菌分离与鉴定的过程，并分析试验结果
(1)Inoculation of Semi-solid Agar Medium半固体培养基的接种
(2)Biochemical reactions生化反应（sugar fermentations糖发酵、IMViC、Hydrogen sulfide 硫化氢(H2S)、Urease尿素酶）
MacConkey test麦康凯实验 (R因子的传递
1.Morphologyof bacteria细菌形态观察Treponema pallidum梅毒螺旋体Treponema pallidum梅毒螺旋体
Leptospira钩端螺旋体Leptospira钩端螺旋体