山东大学2012-2013学年第一学期《组织胚胎学》课程作业
注：L为左；R为右；A为前端；P为后端；蓝色细胞为心脏内膜细胞；红色细胞为将来分化成心室的细胞；黄色细胞为将来分化成心房的细胞。
三、 心肌源细胞的调控—心脏发育的保守途径
心脏特异表达的转录因子是在早期的心脏区域被激活表达的。其中，一个最早的在心肌源细胞中特异表达的转录因子是NKX2.5。对于心肌源细胞的分化最早的研究来源于果蝇。研究发现，果蝇中tinman基因的突变抑制了果蝇心脏的形成。tinman基因编码的是homeobox转录因子，这个因子属于Nkx2基因家族。Nkx2.5是该基因家族的另外一个成员。在目前研究的脊椎动物中nkx2.5于侧板中胚层中正在分化的心肌细胞中表达，并且它的表达贯穿于心脏发育的整个过程。在人和老鼠的心脏发育过程中，nkx2.5的突变都能导致心脏发育的严重缺陷。由于nkx2.5基因表达有高度的特异性和保守性，以及它在心脏形成过程中的重要作用，tinman/nkx 2.5已经成为研究心肌细胞分化的焦点，研究者也在尽力寻找nkx2.5上游的调控基因。NKx2家族的转录因子被相似的信号调控如BMP2（在外胚层中表达）和FGF（两侧胚层中表达）。且在被用BMP2和FGF处理的非心脏中胚层中心脏发生能够被诱导。在斑马鱼中bmp2上的突变废除了NKx2.5和NKx2.7表达。在脊椎动物中心脏的FGF信号作用的基因证据来自于斑马鱼的acerebellar(ace)突变（突变fgf8基因上）。fgf8的表达发生在斑马鱼胚胎中的两侧中胚层。在ace突变体胚胎中，NKx2.5和GATA4的表达减少。且在ace突变体胚胎中引入fgf8能恢复NKx2.5和GATA4的表达。在斑马鱼中，NKx2.5、GATA4、fgf8和bmp4在心脏先祖区域重叠的不同的区域中表达。
NKx家族转录因子在心肌源细胞中表达，其中NKx2.5是唯一的一个被研究在所有模式脊椎动物的心脏始祖细胞中表达的基因。 表达发生在注定发育成心脏的细胞中，而且其表达区域也超出心区向近尾部发展，在不参与心脏发育的细胞中也表达，即使是定型祖细胞被激光切除技术杀死也将如此。脊索则可以提供抑制信号使位于近尾区的细胞不分化成心脏，从而确定心区后段边界。也有人认为是通过抑制NKx2.5的表达而使位于近尾区的细胞不分化成心脏，从而确定心区后段边界。 且NKx2.5还能诱导心肌增生。国外也有报道NKx2-5的表达可促进P19细胞和P19CL6细胞向心肌细胞分化，提高心特异基因的表达，且保护心肌免受胁迫引起的损害。研究证实，NKx2-5基因调控心纳素、心脏a-actin，心锚蛋白重复序列蛋白、A1腺甙受体、钙网织蛋白、间隙连接蛋白40等基因的
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表达。这些目的基因编码重要的结构蛋白转录调控心肌特性，说明NKx2.5有转录调控心肌程序的功能。
Geminin是细胞周期的重要调控因子,在细胞周期中能和Cdt1结合阻止DNA的再次复制，Geminin和cdt1的相互作用对细胞周期的调节非常重要。geminin影响了心肌源细胞的诱导和分化,它抑制了非心脏区域nkx2.5的诱导。另一方面, geminin还影响了胚胎发育的左右平衡，geminin通过改变bmp4的表达模式,影响了bmp4下游的一些途径和因子从而改变了心脏loop的方向,这一途径是与胚胎发育的左右平衡模式相关的。
在心脏的特化过程中，心肌原始细胞产生于前端的侧板中胚层(ALPM)，位于前端侧板中胚层下方的前端内胚层对于调节心肌细胞的诱导就有着重要的调节作用。目前的试验也证实了前端内胚层对于诱导和维持心脏分化进程的重要作用。内胚层能够分泌FGFs、Activin和BMP等多种信号分子。其中，BMP2能够在非心脏的区域诱导心肌细胞marker基因的表达。Noggin和BMPs分子高度亲和，从而阻止了体外培养的侧板中内胚层心肌细胞的分化。心脏分化起初不稳定，需要一个持续不变动的环境刺激来保证心脏分化的稳定发生。在斑马鱼和非洲爪蟾中这种稳定性就是依赖于BMP信号途径，因此，BMP2的存在限定了心脏区域起始分化的界限。
GATA家族是一类具有锌指结构的转录因子，在心脏的形成中也具有重要的作用。在脊椎动物的心脏中表达3种GATA基因：gata4～6。在斑马鱼中，GATA 5的功能与老鼠中GATA4的功能类似。斑马鱼gata5由faust位点编码，对faust突变体的研究表明，在早期的胚胎发育过程中，GATA5对于产生正常数量的心肌前体细胞以及维持一些心肌特异表达的基因，包括nkx2.5的表达水平有重要作用。同时心脏原始细胞向胚胎中轴迁移的过程也需要GATA5的参与，因此gata 5的突变体会导致两侧的心脏原始细胞最终不能融合而形成心脏二分(CardiaBifida)的表型。GATA5的过量表达还导致nkx2.5的异位表达以及形成异位的具有心肌细胞跳动功能的细胞团。
目前在斑马鱼和非洲爪蟾中越来越多的试验证明，用反义morpholino寡聚核苷链工具使gata 6基因的功能缺失后，心脏细胞的分化受到了影响。GATA 6的这种作用更多地体现在心脏原始细胞的成熟过程中，而不是起始诱导的过程。在斑马鱼中已经证明了GATA基因在对nkx2.5的调控和心肌细胞分化中的贡献。据报道，GATA基因和NKX2.5在蛋白质水平有直接的相互作用，从而调控了
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ANF、CARP(cardiac restricted ankyrin repeat protein)启动子等基因的表达。GATA4和NKX2.5共同结合到ANF基因的启动子上，发挥着协同的激活效应：GATA4的碳末端结合NKX2.5碳末端有自主抑制功能的结构域后，导致蛋白质构象的改变，进而暴露出NKX2.5的激活结构域。在这个过程中，GATA5能够替代GATA4和NKX2.5相互作用。因此NKX2.5能募集GATA4或者GATA5形成转录的激活复合体，激活下游某些心脏特异基因的表达。
肌肉细胞特异性增强因子2基因(Myocytespecifific-enhancerfactor2，mef2)广泛存在于果蝇、斑马鱼、小鼠和人类中。mef2基因主要在心肌细胞分化过程中起作用并参与心脏的收缩功能、心肌肌节的组装，mef2a功能下调导致心肌肌节的组装紊乱，mef2a的功能完整是心脏正常收缩所必需的。有假设认为mef2通过与别的谱系限制性转录因子之间进行蛋白质与蛋白质的直接相互作用形成一种联合作用机制，从而激活每一个肌源型的分化程序。如在骨骼肌细胞谱系中，mef2因子就是通过与含bHLH的MoyD转录因子家族成员的作用激活骨骼肌特异转录。研究证实BMP-2和MEF2A在胚胎心脏中共同表达，BMP-2可以调控新生心肌细胞MEF-2A的表达，有人提出了提出BMP2-MEF2A通路调节心脏收缩的模型。适用于mef2激活细胞特异性基因的一般模式也在心脏谱系中发挥其功能，且几个候选分子也许可作为mef2的协同因子，如NKx2.5和GATA转录因子家族成员，及两个bHLH因子—dHAND和eHAND 。但目前还没有直接的证据。
在脊椎动物中有4种含MADS框的mef2基因（mef2a, mef2b, mef2c, mef2d）。它们在发育中的肌肉细胞谱系及别的细胞类型中广泛的表达。它们的蛋白产物（含有MADS区域和高度保守的MEF2区域）只在肌肉细胞、心脏和脑组织中有高丰度。这表明在MEF的调控中存在有后转录调控机制。大量的研究显示，mef2的表达和功能是在多个细胞水平上被调控的，通过多重调控机制作用，一个细胞能保证对mef2活性的严格调控。
四、 WNT11信号途径对心脏原始细胞会聚过程的调控
在脊椎动物胚胎发育的过程中，许多器官的前体细胞诱导分化都是位于体轴的两侧，随后朝着胚胎中轴会聚，最后组装成一个最原始的器官。心脏的发育过程也遵循这样的过程，首先在斑马鱼6个体节发育时期，心肌源细胞从前
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端的侧板中胚层分化出来并且位于体轴的两侧。随后这两侧的细胞再向中间迁移，最终会聚形成原始的管状心脏。如果这一过程受阻，两侧的细胞不能正常会聚，则会出现心脏二分的表型。2000年Heisenberg的研究小组指出，在斑马鱼中，wntll非经典信号途径调节了原肠运动中的向中会聚和延伸的过程(Convergence and Extension Movement)。而后又有研究确定了非经典的Wnt信号途径中参与这一过程的一些分子。后来的研究又迸一步证明了斑马鱼胚胎的会聚延伸运动需要Wnt非经典途径中的一些胞内分子，包括RhoA、Rac1、Cdc42和JNK等。同时Wnt4a和Wntl lr又被确定为调节会聚延伸过程的2个新型分子。而且同时下调Wnt4a和Wnt11r或者下调Wnt4a或Wnt11r与Slb/wnt11的组合，相比下调单个分子而言，会聚延伸过程将出现更严重的缺陷。非经典Wnt信号通路下游有很多的分枝，涉及这一过程调控的有Dvl/RhoA分枝，另外还有Rho Kinase2分枝。在非洲爪蟾和老鼠的研究中还发现，Writ11信号途径还参与了心脏细胞的分化，以及心脏可收缩表型的诱导。而在鸡胚的研究中却发现神经管分泌的Wnt信号能抑制前端邻近的轴旁中胚层心脏的形成。但是在斑马鱼中，目前还没有关于Wnt信号是否对于心脏分化有影响的研究报道。这也说明关于Wnt信号通路在斑马鱼心脏发育过程中的作用还有待进一步的研究。
五、 环化
当斑马鱼心肌源细胞向中融合之后，就会沿前后轴延伸形成心管。在胚胎24 h的时候，心管呈现出向胚胎左侧倾斜的趋势。随后，心管的位置又逐渐返回到体轴中线。48 h之后，心室向右偏转，心房则向左偏转，这样心房心室之间形成了一定的弯曲角度，且位于身体的左侧，这个过程就是心脏的环化过程。如果在24 h时期，心管是向胚胎的右侧倾斜，则到48 h，心脏环化的方向将相反，心脏位于斑马鱼的右侧。从整个过程来看，斑马鱼心脏的左右不对称性在心脏环化过程之前就已经形成了。
心管向右的环化在所有的脊椎动物中均有发生。环化不仅使心管的形态由前后转变为左右结构，而且对于心脏腔室的正确定位和心脏与血管系统的合并是很重要的。虽然dHAND和eHAND分别在左右心室互补性表达，但考虑到他们在侧部中胚层的对称表达，所以认为其不大可能与环化方向的建立有关。而转化因子TGF-β家族成员的左右不对称表达控制心脏环化的方向。Nodal编码
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转录因子调节心脏的左右不对称发育,Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制还并不十分清楚。而且NKx2.5对于发育中心脏的正确环化也是必需的。
胚胎发育20体节的时期(心管融合时期)，BMP4在心脏区域就有非常特异的表达，且正好呈现了不对称性(其他一些基因如nkx2.5、mef2都是对称表达的)。这个时期，BMP4为一环形表达区域，位于头部中后脑边界上方，并且左侧侧板中胚层的表达强于右侧侧板中胚层的表达。研究发现，如果心脏BMP4不对称表达模式的改变，将影响心脏的环化过程。shh在很多系统中都证明位于BMP4途径的上游。在斑马鱼中注射了shh mRNA之后，BMP4的表达增强，同时心脏的环化过程就受到了影响。据报道，以斑马鱼为模型，采用能够热激活的斑马鱼系，研究BMP4信号在左右对称中的影响发现，BMP信号主要影响了发育的2个时期。一是斑马鱼体节形成阶段，在右侧的侧板中胚层区域BMP4抑制了spw的表达，从而调节了内脏和心脏的左右不对称性。在Kupffer’s vesicle中BMP4通过调节leftyl的表达抑制了spw的表达。二是在体节形成阶段晚期，BMP信号途径不再调节内脏发育的不对称性，但是仍然凋节心脏左右发育的不对称性。试验结果表明，BMP4对右侧侧板中胚层中spw表达的抑制，位于Nodal信号途径的上游。而在更晚的阶段，后侧的侧板中胚层中则位于Nodal信号途径的下游，调节着心脏的环化过程。
六、 心室
所有的脊椎动物中，早期功能性胚胎心脏由两腔室构成：心房—它保留薄壁并以低压接收静脉回流；心室—通过在发育中增生和肥大加厚。
Hox基因决定胚胎前后体轴方向结构特异性，它控制细胞分化和个体各部分的复杂形态建成，而视黄酸通过一类依赖于配体的DNA结合受体的家族与基因的结合来直接影响Hox基因的表达。
心房和心室的先祖在早期阶段存在重要的不同。螺旋-环-螺旋基因在心脏腔室的形成中扮演一个重要的角色。dHAND和eHAND在空间上独特的表达模式，使它们成为控制心管节段性发育的候选基因。HAND基因的突变分析表明，其在心脏发生过程中与胚外中胚层、心管和心室的发育有关。但HAND基因的表达是腔室特异性而不是胚胎体侧特异性的，所以它们与心脏特定的腔室分化无关。
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