植物总DNA提取
一、常用方法 改良CTAB法（改良自精编分子植物基因工程，王关林，2002
SDS法（植物基因工程，王关林，高盐低pH值法（邹喻萍，植物生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用）
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂：
(1) 2-巯基乙醇（2-ME） (2) CTAB抽提液 (3) CTAB/ NaCl溶液
(4) 24：1（V/V）氯仿/异戊醇 (5) CTAB沉淀液 (6) 高盐TE缓冲液 (7) 70％乙醇 (8) TE缓冲液 操作：
(1) 称取样品0.2g，去除表面的
DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。
(2) 将冻粉转入2ml离心管中，
立即加入1000μl（980＋20）预热至65℃的CTAB抽提
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂： (1) 2×CTAB提取缓冲液
操作： (1) 2ml离心管中加入1ml提取缓冲液，65℃预热。 (2) 取0.2g新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。 (3) 将呈干粉状态的研磨物迅速转入提取缓冲液中，尽快混2002） 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂：
(1) 提取缓冲液：100mmol/L
Tris·Cl（pH8.0）、50mmol/L EDTA（pH8.0）、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME） (2) 10% SDS (3) 5mol/L KAC
操作： (1) 称取样品0.4g，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。 (2) 将冻粉转入2ml离心管中，加入提取缓冲液900μl（自注：观察此用量合适否），轻学报，1994） 材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。 试剂：
(3) 提取缓冲液：100mmol/L
NaAC（pH 4.8）、50 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、1.4％ SDS，此种介质刚好为pH 5.5。
(4) 2.5mol/L KAc（pH 4.8）
操作：
(1) 称取样品0.4g，去除表面的
DNA污染，加入少许PVP40（相对分子质量为40 000）
置于研钵中与液氮共研成细粉。
(2) 迅速加入2ml预热至65℃的
液，于65 ℃温育30min（10~60 min），并经常温和混匀。
(3)
放至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心5min。
(4)
将上清液转移至新的离心管中，加入1/10体积的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒充分混匀。
(5)
再次加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒使充分混合，于4℃，7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心5min，抽提至上清液澄清（界面无白色沉淀）。
(6)
将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，室温放置15min后（如果沉淀可见，继续做，否则于65 ℃温育30 min），于4℃，10000 r/min
匀，于65℃保温30min。其
间轻柔混匀2~3次。
(4) 取出离心管，冷至室温，加
入1ml的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静置10min。 (5) 10 000r/min离心10 min。 (6) 转移上清液于另一离心管
中，加入2/3倍体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min。
(7) 10 000r/min离心10 min，去
上清液。
(8) 用0.2ml 70％乙醇洗涤沉淀
1次，室温下微干，加入70μl 高盐TE缓冲液和1 μl的RNaseA，颠倒混匀，37℃保温0.5h。
(9) 加入2倍体积预冷的无水乙
醇，充分混匀，于4℃, 7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心15min。
(10) 将沉淀用70%乙醇清洗两次
后，晾干，加入50μl TE溶解沉淀。 轻搅动，使冻粉充分散开。 提取缓冲液，保温30min，(3) 加入400μl 10％SDS，充分
并经常温和混匀（自注：观混匀，于65℃水浴中保温察时间够否，提取液够否）。 10～15min（间隔晃动2～3(3) 在室温下10 000g离心
次）（自注：若裂解不充分可10min。
延长时间）。
(4) 上清液中加入2/3体积
(4) 加入640μl 5 mol/L KAC，充
2.5mol/L pH4.8的KAc溶分混匀，冰浴中放置30min。 液，0℃放置30min沉淀蛋白(5) 4℃ 12 000rpm离心15min。 质。
(6) 上清液转入新的离心管中，
(5) 10 000g，4℃离心10min。 加入等体积的氯仿/异戊醇，(6) 上清液加入0.6倍体积-20℃
轻轻颠倒离心管数次，放置预冷的异丙醇，温和混匀后5min。
于-20℃放置30min使核酸(7) 于4℃下8 000rpm离心
充分沉淀。
10min。
(7) 10 000g离心10min，去上清，
(8) 上清液转入新的离心管中，
将沉淀溶于500μl SDDW加入2/3体积、-20℃预冷的中。10 000g离心10min，上异丙醇，混匀，放置30min，清液转入新的离心管（去除观察DNA沉淀生成。
不溶物）。
(9) 于4℃下8 000rpm离心
(8) 加入0.6倍体积的-20℃预冷
10min，去上清液。（自注：的异丙醇，温和混匀后于观察转速合适否）
-20℃放置30min使核酸充(10) 用80％的乙醇洗涤沉淀，晾
分沉淀。10 000g离心10min。 干10～15min。
(9) 所得DNA沉淀用80％乙醇
(11) 加入400μl TE缓冲液充分溶
洗涤后晾干。
解沉淀（若溶解不好，可置(10) 将沉淀溶解于50μl TE中，
离心5min，弃上清。
(7) 将残液尽可能除尽，加入
200μl的高盐TE缓冲液和2μl RNaseA储备液重悬沉37℃水浴中保温，促进溶
解）。
(12) 5 000rpm离心5min，上清液
转入新的离心管（去除不溶2μl RNaseA储备液，于37℃温育30min，去除RNA后可直接或经一次氯仿：异戊醇抽提后用于酶切及PCR扩淀，于37℃温育30min。 (8) 加入2倍体积预冷的无水乙
醇，充分混匀，于4℃, 7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心15min。
(9) 将沉淀用70%乙醇清洗两次
后，晾干，加入50μl TE溶解沉淀。
自注：红色为与《精编》相比的 改动部分。
二、试剂配制
溶液名（配方来源） 组分浓度 RNaseA 2 000U/ml
物）。加入10μl RNaseA溶液（1μg/μl），于37℃温育30min。
(13) 加入等体积的氯仿/异戊醇，
混匀，放置5min后10 000rpm离心5min，重复一次。
(14) 转移并量出上清液体积，置
新离心管中，加入1/5体积的3 mol/L NaAC，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，室温放置5min。(15) 10 000rpm离心5～10min，
去上清。用80％乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。加入50μl TE溶解DNA，备用。
自注：根据原书按比例改变样品及试剂量
配法 待补
增。
用0.15mol/L NaCl，0.015 mol/L 1 mol/L Tris·Cl（pH8.0）（宝生物商品目录） 0.5mol/L EDTA（pH8.0）（宝生物商品目录）
TE缓冲液pH8.0 （精编分子生物学实验指南）
高盐TE缓冲液
柠檬酸三钠配成10mg/ml；使用前100℃热处理15min除去残留的DNase活性，DNA沉淀溶解后加入1/100体积RNase贮液。分装后-20℃备用。
1 mol/L Tris·Cl 0.5mol/L EDTA 10 mmol/L Tris·Cl，pH8.0
1 mmol/L EDTA，pH8.0 10 mmol/L Tris·Cl，pH8.0
称取12.11g Tris置于烧杯中， 加入约80ml ddH2O，充分搅拌溶解
加入约4.2ml浓HCl 溶液定容至100ml
高温高压灭菌后，室温保存
（应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位）
称取18.61g Na2EDTA·2H2O，置于烧杯中 加入约80ml的ddH2O，充分搅拌溶解 用NaOH调节pH值至8.0（约2gNaOH） （注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解）
溶液定容至100ml
高温高压灭菌后，室温保存 1 mol/L Tris·Cl（pH8.0）1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2ml ddH2O定容至100ml 1 mol/L Tris·Cl（pH8.0）1ml
（精编分子生物学实验指南） CTAB抽提液 （精编分子生物学实验指南） CTAB/ NaCl溶液 （精编分子生物学实验指南）
CTAB沉淀液 （精编分子生物学实验指南） 高盐低pH值法提取缓冲液 2.5mol/L KAC（pH 4.8）
1 mmol/L EDTA，pH8.0 1 mol/L NaCl
于室温保存（可在几年内保持稳定）
2％（W/V）CTAB 100 mmol/L Tris·Cl，pH8.0 20 mmol/L EDTA，pH8.0
1.4 mol/L NaCl
于室温保存（可在几年内保持稳定）
10％ CTAB 0.7 mol/L NaCl 1％（W/V）CTAB 50 mmol/L Tris·Cl，pH8.0 10 mmol/L EDTA，pH8.0 于室温保存（可在几年内保持稳定）
100mmol/L NaAC（pH 4.8）、50 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500
mmol/L NaCl、1.4％ SDS，此种介质刚好为pH 5.5
0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2ml NaCl 5.844g
ddH2O定容至100ml CTAB 2g 1 mol/L Tris·Cl（pH8.0）10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）4ml NaCl 8.1816g
在40ml H2O中溶解2.05g NaCl，缓慢加入5g CTAB，同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容终体积至50ml。自注：在烧杯中配制，不定容。
CTAB 1g 1 mol/L Tris·Cl（pH8.0）5ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）2ml
待补 冰乙酸调pH 称取14.7g乙酸钾，溶于60mlddH2O中，
溶解后再加入5.75ml冰乙酸，定容至100ml，所得溶液称为2.5mol/L KAC，溶