与分析，实现了工业生物过程的优化与放大。
（1）在头孢菌素C发酵过程放大研究中首先发现了细胞宏观代谢流特征参数呼吸商（RQ）在小试50L发酵罐和工业规模160 m3发酵罐上的差异，并通过相关分析，发现了大型工业发酵罐中，后期流加的基质——油的利用程度大大低于小试发酵罐；与此同时，通过计算流体力学对工业规模发酵罐的流场特性研究表明：由于反应器中搅拌形式的不合理而导致反应器的混合特性差，基质在工业规模罐中的分布存在浓度梯度，影响了细胞对基质利用，导致基质利用率低、发酵单位低；在找到问题症结后及时调整了发酵设备，改善了反应器的混合问题，提高了基质的利用程度，使发酵单位提高20%。
（2）在红霉素发酵过程研究中，通过50L小试发酵罐、120吨和370吨工业规模发酵罐的同步研究，并在发酵容积从120吨放大到380吨时，利用计算流体力学方法对反应器的流场特性进行了研究，并采取了对16米高的反应器多点、多参数的检测与校验，证明反应器的混合特性利于红霉素发酵过程，在研究过程中发现基于细胞宏观代谢特征参数氧消耗速率OUR的前期调控是过程优化与放大的关键，实现了宏观代谢流参数如OUR、CER等的趋势一致，实现了从120吨到380吨放大研究，红霉素发酵单位提高30%以上，三年新增利税2.5亿多元，实现了大宗发酵产品清洁生产，发挥节能降耗减排的重大作用；创新点：(A)实现红霉素工业生产菌株代谢工程改造，使发酵液中红霉素有效组分A比例明显增加；(B)建立基于多尺度参数相关分析的红霉素发酵过程动态优化与放大方法，大幅提高工业规模发酵水平和发酵指数；(C)提出反应器流场特性与菌体生理特性研究结合的放大原理；(4)建立工业生产规模微滤、纳滤组合膜分离技术,实现节能、降耗、减排生产新工艺。该技术处于国际先进水平。
（3）在克拉维酸和维生素B12等产品中，分别实现了从50L向60吨和120吨发酵罐的放大，而发酵单位分别提高了30%和100%以上；课题组进一步建立和完善了下述工业生物技术产品过程优化研究中的技术平台建设：新型生物过程在位检测技术与方法，如发酵过程在线尾气质谱仪的应用、具有国际首创的原位细胞形态观察仪的研制与应用、用于厌氧发酵过程的氧化还原电位电极的应用研究等，为更好地实施工业生物过程的实时优化奠定了坚实的基础；将前沿生物技术的最新进展应用于工业生物过程的过程研究中，如在阿维菌素工业发酵过程中开展了转录组学、蛋白质组学应用研究，为工业发酵过程调控又提供了新的视角；生物过程在线数据处理网络系统与数据库的建立，为实现工业发酵过程的异地远程专家实时诊断奠定了物质基础。
（4）另外在多个工业生物技术品种中的开发出了各种新型优化技术，如丙酮酸发酵过程中基于代谢工程控制的原理，建立了多项过程调控的新方法，实现了过程的优化研究，使产品的发酵单位有了大幅度的提高。
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2.4 生物/化学方法级联设计与调控 2.4.1 生物过程高效全局优化原理与方法
（1）构建全局转录调控新方法 （A）微生物法生产透明质酸
建立了高产透明质酸重组菌的两步高通量筛选方法，进一步构建了大肠杆菌RNA聚合酶中的两种sigma因子：sigma D和sigma S因子的随机突变库，并实施了半透明菌落定性筛选－Alcian blue染色定量筛选等两步高通量筛选方法，获得了产量显著提高的重组菌株。 （B）微生物法生产丙烯酰胺 ① 化学工程工艺设计与优化
从化工过程优化与控制的角度，对微生物法生产丙烯酰胺的发酵过程、催化剂制备、水合反应、产物分离纯化、浓缩、结晶等各个工序分别进行了设备和工艺的优化设计，并与生物催化剂（产腈水合酶的红球菌细胞）的改造相结合。 ② 细胞工程手段改造细胞的催化性能
成功筛选获得了一株高腈水合酶活性的菌株，命名为红色红球菌TH（Rhodococcus ruber TH）。酰胺酶基因在R. ruber TH3(amdA-)突变株中的阻断表达促进腈水合酶的表达，酶活水平比对照菌株提高20％。在采用游离细胞催化丙烯腈生成丙烯酰胺的过程中，酰胺酶基因阻断突变株的产物生成量比野生对照株提高23％，水合液中副产物丙烯酸的生成量比野生对照株减少了87％。将水合温度从25℃提高到40℃，丙烯酰胺的积累仅仅减少了4％，副产物丙烯酸的生成虽然有所上升，但仍然仅为野生菌25℃水合时的1/3。
③ 微生物法生产丙烯酰胺的分子层次调控－酶工程方法解析腈水合酶的催化机制及热稳定性改造
分别采用生物信息学半经验量子力学和分子动力学计算，对腈水合酶的催化提出了腈水合酶的催化新机制，发现了热敏感区域，机制和热稳定性进行了研究。提出了热稳定性强化的改造策略。
（C）构建丙烯酸大宗化学品生物合成新路线
酰胺酶在大肠杆菌中表达后，以溶解蛋白和包涵体形式存在于菌体细胞。在枯草芽孢杆菌中表达后，浓缩收集后测定浓度，测量所表达的酰胺酶的最适酶活条件和表达效果。检测了酰胺酶在大肠杆菌，枯草芽孢杆菌amyE启动子, sacB, p43, degQ,和aprE启动子及原始红球菌中表达的结果。酰胺酶在amyE启动子调控下在枯草芽孢杆菌中的表达量和酶活最高。枯草芽孢杆菌中以amyE为启动子表达的酰胺酶在6小时内，由丙烯酰胺转化为丙烯酸的摩尔转化率可达到90%。
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克隆并表达了丙酸梭菌中与丙烯酸代谢相关的两种酶：乳酸辅酶A转移酶（pct）及乳酸辅酶A脱水酶(lcdB)。液相色谱测量，丙烯酸最终平均浓度最高约为0.1g/L.质谱检测发酵产物。
成功克隆了酰胺酶基因ami，构建质粒pET-22b，在大肠杆菌（E.coli）BL21(DE3)中获得表达。结果表明ami基因在大肠杆菌中表达后，蛋白比酶活可达到2.8U/mg, 蛋白表达量可达1.7mg/ml。
以枯草芽孢杆菌为表达宿主，选择5个调控强度不同的启动子（amyE, sacB, p43, degQ, aprE）分别表达酰胺酶，结果表明以amyE为启动子ami基因表达效率最高，比酶活可达8.7U/mg, 表达量可达2.3mg/L，比原始菌提高了4倍。在最适温度37℃，最适pH值7.0时，6小时内丙烯酸的转化率可达到90%。 （2）构建生物基化学品绿色合成新过程 （1）脂肪酶绿色催化过程调控 （ⅰ） 酶法合成棕榈酸异辛酯
开发了固定床式酶膜反应器，利用该固定化脂肪酶催化棕榈酸和异辛醇的酯化反应，以石油醚为反应溶剂，40℃下反应12h转化率可达到97%，固定化酶可重复使用30次。建立了300升酶法合成棕榈酸异辛酯的装置，产品纯度达到98%以上。该产品的酶法合成工艺的质量和成本均优于化学法。 （ⅱ）酶法合成二元酸酯
通过非水相中固定化脂肪酶催化合成二元酸酯，固定化脂肪酶对不同的二元酸如己二酸、壬二酸以及癸二酸展现了优良的酯化活性，酯化率达到95%以上。以癸二酸异辛酯为例，转化率可达97.5%,在批式反应器中，固定化脂肪酶可连续使用40批次，转化率保持在90%以上。 （ⅲ）酶法合成维生素系列脂肪酸酯
① 酶法合成维生素A棕榈酸酯
固定化酶催化维生素A醋酸酯的转酯化反应转化率为82%。将维生素A醋酸酯水解成维生素A，然后用维生素A与棕榈酸酯化得到维生素A棕榈酯，最终转化率大于90%，底物摩尔比（维生素A/酸）1:1，固定化酶使用50次转化率依然有85%以上，经分离纯化后产品纯度达到95%，收率大于85%。 ②酶法合成维生素C棕榈酸酯
采用实验室自制固定化脂肪酶催化合成维生素C棕榈酸酯，转化率可达80%，产品纯度>95%。 （ⅳ）酶法合成生物柴油
成功地开发了以废油脂为原料，通过甲醇解酶法合成生物柴油（脂肪酸甲酯）的工艺。以石油醚为反应溶剂，40℃下反应24h , 分三步加入等摩尔比的甲醇，生物柴油的转化率达到95％。生物柴油经过测试，达到目前国际上公认的指标
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最高的德国标准。 （ⅴ）手性酸的酶法拆分
脂肪酶Candida sp.99-125也具有较高的对映体选择性，能选择性酯化S-布洛芬生成S-布洛芬酯，酶的立体选择性E可达400，制得的S-布洛芬纯度可达99%。此酶对酮洛芬和萘普生等也有较高的选择性。 （2）1,3-丙二醇过程调控与优化
以克雷伯氏菌出发，利用同源重组手段，底物的转化率提高了38%，1,3-丙二醇产物浓度无明显变化。
构建了1,3-丙二醇代谢途径中关键酶——甘油脱水酶及醇氧化还原酶基因的表达载体，关键酶酶活大幅提高，1,3-丙二醇产物浓度提高29.8%，生产效率提高50%。使用构建好的重组克雷伯氏菌，进行了5L、30L及300L发酵罐的实验，1,3-丙二醇产量分别达到83.6 g/L、89.1 g/L及82 g/L。 （3）琥珀酸发酵的过程调控
高产琥珀酸的菌株其细胞代谢过程中均产生高活性的富马酸脱氢酶。根据这一点特性，设计出以富马酸钠为唯一碳源的选择性平板，筛选出能够利用富马酸钠的菌株。薄层层析复筛出29株菌可以产琥珀酸，部分菌株以玉米秸秆稀酸水解液作碳源发酵，琥珀酸产量接近1g/L。
2.4.2生物/化学体系物质和能量与生物转化规律
（1）生物法制天门冬氨酸；固相聚合制聚天门冬氨酸
对现有的富马酸合成天门冬氨酸的菌种进行了诱变，富马酸转化率达99％。采用控温冷却模式，天门冬氨酸的结晶收率达92％。
开发了一种新的捏合式搅拌技术，这种反应器可有效的克服天门冬氨酸聚合过程中膨胀硬化阶段，改进工艺后催化剂减少到原加入量的三分之一，反应时间由原来的每批次4小时缩减到3小时，节省了成本，提高了反应效率，缩短了反应时间。
（2）酶催化合成低分子量PBS聚酯；化学聚合合成高分子量PBS聚酯
首先采用固定化酶布合成了低分子量的PBS聚酯，最优反应条件为：丁二酸0.001mol、醇0.001mol、酶布(3×3 cm2)剪碎、硅胶0.5g、环己烷2.5ml以及搅拌。采用周期性抽真空的方法，排除反应中不断产生的水分子，使反应持续向正反应方向进行，来提高聚合物的分子量。向上述采用固定化脂肪酶法合成的含有寡聚的酯反应液中加入氯仿，将聚酯全部溶解，然后用布氏漏斗进行抽滤，将滤液合并，在减压条件下进行旋转蒸发，浓缩液用甲醇进行沉淀，二次在减压条件下旋转蒸发，可以得到初级产品，即寡聚的酯。接下来，向浓缩液中加入适量的溶剂和剪碎的酶布，通过水泵在减压抽真空条件下进行反应2小时。之后，再次加入氯仿溶解产品、抽滤，通过2次旋转蒸发，最后用甲醇沉淀出目标产品，
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即聚酯的粗品。
（3）发酵法制乳酸；化学催化合成丙烯酸
初始培养基与只流加碳源时相同，流加底物含有830g/L的葡萄糖及干重25g/L的豆粕水解液。当发酵进行到20小时菌体生长处于最旺盛时期，此时开始流加，保持残糖浓度维持在30g/L附近，当发酵进行到58小时停止流加。L-乳酸最终产量162.5g/l，转化率为95.5%，比生产速率为1.69g/l/h。
初步确定了以乳酸\\乳酸甲酯\\乳酸乙酯为原料的气相催化合成方法。得到了两种不同类型非常有深入研究价值的催化剂，一个是13X分子筛，另一个是磷酸盐催化剂。 固体酸催化剂：一次混合直接成浆比分次浸渍焙烧效果好，最佳催化剂焙烧温度为430℃，含水量40%乳酸甲酯效果最佳。得到产物最佳收率60.1%。 分子筛催化剂：比较乳酸、乳酸甲酯和乳酸乙酯三种原料，三种原料的最高收率分别是37.2%、31.2%和38.5%，在汽化温度235℃时，产物选择性可达50%以上。磷酸盐催化剂：在汽化温度为235℃时，以60%乳酸甲酯水溶液为原料，最高收率大于30%。
为使杂多酸和13X均能在其最佳反应条件下发挥其催化性能，实验采用二段反应，将13X和杂多酸催化分别置于串连的两个反应器中，13X在上，反应温度为300℃（13X的最佳反应温度），杂多酸在下，反应温度400℃（杂多酸的最佳反应温度）, 使得两种催化剂都能在各自最佳条件下反应，产物选择性有明显提高，丙烯酸及其酯选择性最高达到80%左右。
2.4.3 多产物匹配的物质流与能量流
（1）谷胱甘肽联产麦角固醇和SAM
采用高密度发酵技术可以获得130 g/L以上的酵母细胞，根据反馈前及时控制葡萄糖流速的方法，发酵过程细胞浓度达到OD660≥300且谷胱甘肽产量达到800 mg/L麦角固醇产量达到1400 mg/L后，开始向发酵液中一次性添加10mmol/L的三种前体氨基酸（谷氨酸，甘氨酸，半胱氨酸）。发酵40 h后，麦角固醇产量高于1400 mg/L而与此同时谷胱甘肽产量也超过了2100 mg/L。
利用酿酒酵母菌株高密度发酵法生产S-腺苷蛋氨酸关键的影响因素是前体L-蛋氨酸的补加策略，最终确定了L-蛋氨酸的加入时机为30小时左右，菌体干重达到100g/L，补加量为每罐40gL-蛋氨酸，发酵58小时左右达到最高生物量干重160g/L，产量12.5g/L, 前体转化率30%左右。
（2）新型固定化纤维床反应器生产丙酸联产VB12
以自行筛选的丙酸高产菌Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015为研究对象，成功构建了一种多点式纤维床反应器MFB，丙酸产量达67.05 g/l，连续生产丙酸时间达2个多月，总酸产量已达436 g/l。对纤维床固定化反应器与中空纤维模联用，通过批式发酵提高了丙酸的生产效率达0.8 g/l/h, 是游离细胞
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