培养生产丙酸效率的4倍以上。研究了溶氧对于VB12生产的影响，VB12产量已达25 mg/ml。采用两步控制pH策略生产丙酸，效率提高32％。丙酸与副产物乙酸比例（mol/mol）由2.1上升为4.06。研究了以海藻酸钠－聚乙烯醇为固定化载体的丙酸菌固定化生产方法，其生产效率明显高于游离细胞。
2.5 工业生物过程单元耦合与集成
2.5.1 制备了聚苯乙烯、环糊精基键合介质多种分离介质
（1）利用膜乳化技术制备了尺寸均一的聚苯乙烯介质
利用膜乳化技术，研制出适于多孔分离介质规模化制备的高通量型膜乳化设备。可以在操作过程中使用不同孔径的微孔膜制备5-100μm范围内液滴直径不同的乳液，所制备的液滴呈均匀球形，粒径均一，CV值小于20%；连续两批产品的粒径重复性在10%以内。
（2）环糊精基键合介质制备、应用及分离机理探讨 (A) 环糊精配基键合介质的制备
以环氧氯丙烷为间臂分子，合成凝胶（Superose 12 HR (10/30)和Sepharose HP）键合环糊精介质和聚苯乙烯固载寡聚β-环糊精介质，提取中药提取物中的活性成分。获得专利：环糊精分子印迹分离天然产物新方法，专利号：CN1473862。
Sepharose HP键合环糊精固定相从葛根黄酮中分离纯化葛根素，一步收率62%，纯度98%。比传统的分离方法提高30多倍
(B) 探讨作用机理
采用红外IR、NMR和分子模拟等分析手段对配体分子和活性分子之间的作用进行分析。利用NMR等技术深入探讨了环糊精键合介质分离天然产物的作用机理。从介质物性上分析， Superose 12凝胶介质由12%琼脂糖凝胶经高度交联而成，含有大量醚键和C4等短链烷烃基团。醚键结构提供大量孤对电子，以受体的形式参与氢键吸附；同时，短链烷烃为样品保留提供疏水作用。有关结果发表在 Carbohydrate Research, 2007, 342: 843-850.
（3）聚N-异丙基丙烯酰胺/壳聚糖粒状半互穿网络水凝胶制备及应用。
对新型分离介质的制备和应用进行探索，用反相悬浮聚合法，合成了具有温度/pH敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺/壳聚糖粒状半互穿网络 (PNIPA/CS semi-IPN) 水凝胶。
（4）制备了多种不同孔径的有机-无机杂化渗透汽化优先透醇膜。
通过对无机沸石合成反应的系统研究，发现碱用量、反应物浓度、模板剂用量和反应时间均影响沸石对丁醇吸附量、沸石产率。获得的渗透汽化透醇膜对丁醇/水选择性最高为104，通量为105kg/m2.h。
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2.5.2 构建3种反应/分离耦合新方法
（1）膜分离耦合乳酸发酵的研究
以乳酸发酵体系为研究对象，开展膜细胞循环连续发酵与分离耦合生产乳酸研究，在系统实验的基础上，建立乳酸发酵－膜分离耦合新工艺和装置，通过理论分析和系统的过程优化，提高乳酸发酵产率，降低生产成本。研发的旋转膜组件可以增加错流速度从而降低膜污染。整个发酵流程经过分批发酵、分批补料发酵和分离耦合发酵三个流程。乳酸的产率增加了1.8倍。 （2）丙酸的在线分离与VB12/丙酸高效联产发酵
主要研究费氏丙酸杆菌的VB12/丙酸联合发酵和丙酸的在线分离技术。对比了 9 种弱碱性阴离子交换介质对费氏丙酸杆菌发酵液丙酸的静态吸附，筛选出介质 ZGA330，对丙酸吸附量为 205.5mg/g。利用ZGA330介质扩张床动态吸附分离VB12发酵液中丙酸，结果表明经过扩张床吸附的含有菌体细胞的发酵液丙酸含量大大降低，而葡萄糖和氨基酸大部分保留，同时菌体细胞未受到明显影响。与未分离丙酸的发酵液混合后继续培养菌体密度和VB12的产量显著提高。进行了扩张床吸附丙酸溶液和发酵液中的丙酸的优化实验，考察了扩张床定时吸附丙酸对菌体生长及合成VB12的影响。将介质处理成-OH，利用-OH型介质本身的“固体碱”作用调节发酵pH并吸附丁二酸；建立了丁二酸发酵与固定床和扩张床吸附耦合的过程和实验装置。整个过程实现扩张床吸附与发酵耦合。VB12的浓度从9.1提高到13.1mg/L，增加了43%。
2.5.3 建立了连续离子交换与膜分离耦合新方法
建立了连续离子交换技术和装备，将多柱相互集成，并最终与膜分离单元相结合，实现了目标产物的连续吸附、连续洗脱、连续浓缩，有效缩短了分离的操作流程和时间，明显提高了分离效率，并显著降低了物耗、能耗和资源消耗。
目前利用该技术已实现包括核苷三磷酸、核苷酸等产品的高效分离，分离收率均超过文献报道。此外，本项目还将利用此技术分离其他多种物质，如胞二磷胆碱(cytidine-5’-diphosphate choline, 简称CDPC)。
在静态条件下，研究了SH15树脂吸附水溶液中胞二磷胆碱(CDPC)的热力学和动力学特性，并采用模拟移动床对胞二磷胆碱的连续离交过程进行了初步研究，最终产品的分离收率达到91.9%，超过文献报道的80.9。
2.6 工业生物过程的系统控制与优化
工业生物过程是利用微生物细胞或酶的催化功能，将生物质或生物质提取的有机原始材料转化为化学品、材料及能源的过程。作为一个包含多组成、多维和
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多子系统的体系，涉及原料制备、预处理、水解、发酵(微生物转化)、产物回收、废渣管理和废水处理等操作单元，因此，作为这些单元的整合，工业生物过程的系统优化比个别过程的高效更为重要，从而实现典型的工业生物过程的目标：高过程效率、高产品价值、低污染排放。课题六围绕工业生物过程的系统优化的三个关键目标：高效率、高价值和低污染，在(1) 微生物细胞功能调控；(2)多级酶转化；(3) 废物二步发酵资源化三个方面开展工作，取得了：(1) 环境条件优化和基因改造提高微生物转化；(2)发酵副产物甘油微生物转化生产高价值产品；(3) 有机废物二步发酵资源化生产纺织酶制剂并应用于纺织工业中等关键技术。
2.6.1 环境条件优化和基因改造提高微生物转化能力
⑴ 调控辅因子提高微生物代谢速率
辅因子工程是采用分子生物学的手段，改造细胞内辅因子的再生途径，改变微生物细胞内辅因子的形式和浓度，定向改变和优化微生物细胞代谢功能，实现细胞代谢流最大化、快速化地导向目标代谢产物的合成。辅因子工程所涉及到的辅因子有：ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+、乙酰辅酶A及其衍生物、维生素和微量元素。其中，NADH/NAD+作为重要的辅因子全程参与了微生物细胞内300多个氧化还原反应。
调控胞内ATP含量加速糖酵解速度：利用高溶氧条件下阻断电子传递链和低溶氧下提高乙醇脱氢酶活性的方法，研究改变T. glabrata 中NADH氧化途径对能量代谢和酵解途径的影响。通过阻断电子传递链或降低溶氧水平能有效抑制NADH通过氧化磷酸化途径氧化且显著降低了胞内ATP水平，在添加外源电子受体乙醛的条件下，将NADH氧化途径从产生大量ATP的氧化磷酸化途径转向无ATP产生的乙醇发酵途径，从而加速葡萄糖代谢和提高丙酮酸的生产强度。
调控胞内NADH氧化途径加速丙酮酸生产强度：将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于T. glabrata中，获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 U/mg蛋白质的重组菌T. glabrata-PDnoxE。NADH氧化酶作用于细胞质中，将细胞质中NADH氧化为NAD+，同时生成水。与出发菌株T. glabrata相比，T. glabrata-PDnoxE发酵中NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%，而NAD+增加了11.1%，细胞浓度、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%。发酵进行到36 h葡萄糖消耗完毕，补加50 g/L葡萄糖继续发酵20 h则使丙酮酸浓度提高到67.2 g/L；在T. glabrata中表达来源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)中编码选择性氧化酶的AOX1基因，获得一株选择性氧化酶活性为1.64 U/mg蛋白质的重组酵母T. glabrata-AOX1。选择性氧化酶存在于线粒体，在线粒体内将NADH直接氧化为NAD+，大大削弱细胞的呼吸作用。选择性氧化酶的表达，使
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胞内NAD+含量增加了69%，ATP含量降低了50.1%。在含有100 g/L葡萄糖的发酵培养基中，与出发菌株比较，细胞浓度降低了21.2%，葡萄糖消耗速度和丙酮酸浓度则分别增加了31.17%和38.1%。
调控乙酰辅酶A合成途径促进α-酮戊二酸生成：为了研究乙酰辅酶A及其衍生物在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量的影响。将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulopsis glabrata中，获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高了9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrata ACS2-1。与出发菌株WSH-IP303相比，重组菌T. glabrata ACS2-1：(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94 mM/ g DCW的乙酰辅酶A；(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303 的3.22、2.05和2.52倍；(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L乙酸，导致乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍，α-KG浓度达到17.8 g/L。将来源于酿酒酵母中编码丙酮酸脱羧酶PDC1基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulopsis glabrata中，获得了一株丙酮酸脱羧酶活性提高了14.2倍(7.22±0.09 U/mg protein-1)的重组菌T. glabrata PDC1-1。在葡萄糖培养基中添加30 g/L丙酮酸时，重组菌T. glabrata PDC1-1与对照菌株T. glabrata::pYES2相比：(1) 丙酮酸脱羧酶活性提高了14.16倍(7.22±0.09 U?mg of protein-1)；(2) 重组菌株T. glabrata PDC1-1的丙酮酸产量、α-KG产量和Cα-KG/Cpyr分别为：28、38.8 g/L和1.39，分别是对照菌的65%、182%和284%；(3) 重组菌T. glabrata PDC1-1胞内acetyl-CoA节点代谢通量和acetyl-CoA/CoA比对照菌分别提高了1.98倍和2.24倍，达到14.61 mmol/g DCW和3.92，而CoA浓度则降为11.1%；(4) T. glabrata CCTCC M202019是乙酸渗漏缺陷型菌株，其丙酮酸脱羧酶活性组成型降低。在普通发酵培养基中重组菌T. glabrata PDC1-1的PDC1活力是T. glabrata CCTCC M202019菌株的15.63倍，其中α-KG的产量和Cα-KG/Cpyr比值分别是其的4.55倍(31.2 g/L)和7倍(1.68)，达到而重组菌T. glabrata PDC1-1丙酮酸产量是T. glabrata CCTCC M202019菌株的49.3%。
⑵ 利用代谢工程提高微生物抵御环境胁迫能力
谷氨酰胺转胺酶过量合成促进乳酸乳球菌抵御酸胁迫：在乳酸乳球菌NZ9000中导入具有活性的微生物来源的谷氨酰胺转胺酶(MTG)，可以使细胞好氧生长能力明显增强(尤其是在不控制pH的培养条件下)。研究发现导致这一现象的原因包括：(1)产生铵；(2)胞内pH(pHin)升高导致乳酸脱氢酶活性降低但NADH氧化酶活性提高；(3)丙酮酸节点的代谢流向发生改变，酸性代谢物产生明显减少。导入具有活性的MTG也可以显著增加乳酸乳球菌NZ9000对氧胁迫的抗性。原因之一是发现MTG自身具有直接清除H2O2和O2-的微弱抗氧化活
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性。此外，MTG能够增强处于对数前期的乳酸乳球菌NZ9000对酸胁迫的抗性，但会削弱处于稳定期的乳酸乳球菌NZ9000对酸胁迫的抗性。可能的原因是较高的pHin会抑制乳酸乳球菌NZ9000自身酸胁迫诱导型的抗酸胁迫机制的活性。
谷胱甘肽保护乳酸乳球菌抵抗氧胁迫：在高致死率的胁迫或宿主菌自身抗性被削弱的条件下，利用代谢工程手段导入的谷胱甘肽(GSH)能够保护乳酸乳球菌NZ9000增强对氧胁迫的抵抗能力。提出了可能的保护机制，即通过导入GSH生物合成能力，乳酸乳球菌NZ9000胞内形成了一个具有活性的依赖于GSH的还原系统。在乳酸乳球菌SK11中生产GSH可以显著提高宿主菌的好氧生长性能和pHin。同时，GSH能够增强乳酸乳球菌SK11对氧胁迫和酸胁迫的抗性。GSH在乳酸乳球菌SK11抵抗酸胁迫中的可能生理机制是：GSH通过与胞内的某种物质发生非循环式反应，转变成为某种碱性物质，从而提高pHin。
脯氨酸保护光滑球拟酵母抵抗渗透压胁迫：研究了不同氯化钠浓度下光滑球拟酵母内氨基酸浓度的变化，及氨基酸对细胞生长和丙酮酸积累的促进作用。恒化系统中(D=0.05 h-1)中，随着氯化钠浓度(0~50 g/L)的增加，脯氨酸的浓度增加了296%。高氯化钠浓度下，T. glabrata吸收脯氨酸作为相容性溶质以抵御高渗透压的胁迫。添加1.0 g/L脯氨酸，使高渗条件下细胞浓度分别提高73% (50 g/L NaCl)和28% (80 g/L NaCl)。在丙酮酸发酵过程中添加1.0 g/L脯氨酸则促使发酵周期缩短8 h，丙酮酸产量和生产强度分别提高5.4%和18.6%。
2.6.2 发酵副产物甘油微生物转化生产高价值产品
⑴ 高纯度井冈霉素生物催化生产井冈霉醇胺的产业化技术开发
筛选得到能够高效催化裂解井冈霉素并应用于大规模生产井冈霉醇胺的微生物新菌株，其生物催化活力居国内外最高水平；建立了生物催化新工艺，产业化中裂解产物井冈霉烯胺浓度高达2000μg/ml以上；研究了高纯度井冈霉素裂解产物分离新方法，缩短了工艺流程，解决了分离难题，产品收率从31%提高到76%以上。开发了井冈霉素新一代生产工艺用于高纯度井冈霉素的生产，100吨发酵罐井冈霉素A发酵效价从10000μg/ml提高到30000μg/ml以上，原料成本下降近70%，成为全球时空产率最高和成本最低的抗生素，建立了节能减排分离新工艺，能耗和废水排放减少20%以上，井冈霉素从10%以下的低纯度粗制品提高到60-90%高纯度制品。 本技术先后在浙江钱江生物化学股份有限公司和浙江桐庐生物化工有限公司实现产业化，建成了国内外生产能力最大的新产品井冈霉醇胺和高纯度井冈霉素生产线，实现了规模化生产。井冈霉醇胺作为关键中间体用于生产新一代酶抑制剂类糖尿病治疗药物，高纯度井冈霉素是生物农药新规格高端品种。本技术成功打破了国外技术和市场的垄断，具有自主知识产权，产品出口国际市场，高纯度井冈霉素国内外市场占有率第一，显著提升了国内生产厂家的国际竞争力及在该领域的影响力。
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