②比色法:有试纸法和标准管比色法。
③化学法—利用蔗糖的转化速度、重氮基醋酸乙酯或乙缩醛的分解速度来求pH值。 三、 挥发酸的测定
包括哪些：食品中的挥发酸主要是低碳链的脂肪酸，主要是醋酸和痕量的甲酸、丁酸等。不包括乳酸、琥珀酸、山梨酸及CO2、SO2等。 原理
直接法：直接用标准NaOH滴定由水蒸气蒸馏或其它方法所得到的挥发酸。
间接法：将挥发酸蒸发除去后，滴定不挥发残液的酸度，最后由总酸度减去此残液酸度即得挥发酸的含量。
水蒸汽蒸馏法测总挥发酸
原理：样品经适当的处理后，加适量磷酸使结合态挥发酸游离出来，用水蒸气蒸馏分离出总挥发酸，经冷却、收集后，以酚酞做指示剂，用标准碱液滴定至微红色，30秒不褪色为终点，根据标准碱的消耗量计算出样品总挥发酸含量。反应式同“总酸度的测定”。 加磷酸目的：使结合态挥发酸游离出来。 思考：滴定法使用酚酞作指示剂测定一个加热沸腾和一个没有加热沸腾的碳酸饮料，哪一个样品会有较高的滴定酸度？为什么？
准备测一没有经过巴氏消毒样品的pH，由于事情耽误了一段时间。过后，测定时，先用标准的缓冲溶液校正pH计，取出在4℃冰箱内放置的苹果汁，然后测定pH 。解释为何测定的pH不准确？
6、蛋白质的测定
本章重点：凯氏定氮法的原理及注意事项、甲醛滴定法测定氨基酸方法原理及操作 一、凯氏定氮法（全面掌握） 常量凯氏定氮法 1. 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 ① 消化
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4=(NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 加试剂作用：<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点 <2>加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂 <3>加氧化剂 加速有机物氧化速度 ② 蒸馏
NH4+ + OH-= NH3 +H2O
影响氨化完全和速度的因素：（1）K氏烧瓶和取样量；（2）分解剂 1g样品 K2SO4： H2SO4 = 7g : 12ml
还有一种比例： K2SO4： H2SO4 = 10g : 20ml ③ 吸收与滴定
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定
指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿） 指示剂 ：红色 →绿色 →红色 （酸） （碱） （酸）
反应式为：2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。 讨论：现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h后，估计消化完全，取出消化液加入少量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。
计 算：?
X为样品中蛋白质的含量；V1为样品消耗盐酸标准液的体积；V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积；C为盐酸标准液的浓度；MN为氮的摩尔质量；W为样品的质量；K为氮换算为蛋白质的系数
称取某均匀样品0.42g，已知其蛋白质的含量为样品总量的13.00%，经消化后定容至100 mL，吸取5 mL消化液于反应瓶中，加碱煮沸，用吸收液吸收后，用0.01N盐酸滴定，消耗盐酸3.00 mL，计算该样品蛋白质换算系数。
采用凯氏定氮法测一样品粗蛋白含量，根据下列计量计算：
?水分含量=8.0%，1号样品质量=1.015 g，2号样品质量=1.025 g，用于滴定标准HCl浓度=0.1142 mol/L, 1号样品消耗HCl 22.0 mL，2号消耗22.5 mL，空白样品0.2 mL，分别以干基和湿基计算粗蛋白含量，假定该蛋白质含量为17.5%的氮。 二、双缩脲法
NH2—CO—NH2+ NH2—CO—NH2（△150~160℃）NH2—CO—NH—CO—NH2（双缩脲） + N 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物。
计算：取两组测定的平均值计算：固体样品蛋白质的含量 Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml）；N为稀释倍数； c为样品原浓度（mg/ml） 三、福林-酚法（双缩脲法的发展）
两步反应：(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质—铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。 四、杜马斯法（燃烧法）
样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
某厂质检员预对当日生产的一批共10000罐红烧肉罐头（每瓶净重350g）抽检测定其中蛋白质含量，请设计常量凯氏定氮法测定其中蛋白质含量的大致方案。蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要用硫酸调成酸性?消化过程中内容物的颜色会发生什么变化？若红烧肉的水分含量为60%，样品重量1.0025g，用于滴定的标准HCl浓度为0.1142mol/L，样品所用的HCl溶液的毫升数为22.00mL，空白消耗HCl溶液的毫升数为0.20mL，假定该蛋白质含有17.5%的氮，则蛋白质系数是多少？红烧肉的粗蛋白质含量是多少？ 总氨基酸的测定原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。其最低检出限为10pmol。 游离氨基酸的测定
原理：游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化合物二酮茚－二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉
具体方法：将反应之后的样液加入等体积10%TCA，混匀静止2h，用双层滤纸过滤，经高速
离心机10000rpm离心10 min，移取上清液400μl至进样瓶，等待进样。 食品中氨基态氮的测定（全面掌握）
甲醛滴定法（每一步的目的（只找到这个，和黑色部分意思差不多）：－NH3是弱酸，完全解离时PH为11－12或更高，若用碱滴定－NH3所释放的H＋ 来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，促使 －NH3释放H＋ ，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。）：氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。 双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂
同时取两份样：① +中性红，用NaOH滴定；② +百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定 非水溶液滴定法：在水溶液中：1、能溶解的物质有限，尤其是有机物质；2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄；3、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。 溶剂选择原则：1、不引起副反应；2、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物；3、应考虑溶剂的酸碱性 （对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好）
氨基酸的非水溶液滴定：1、选择冰乙酸作为溶剂；2、选择高氯酸进行滴定 7、高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱法:High Performance Liquid Chromatography,简称HPLC, 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它是在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、高效分离柱、专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。
按分离机制分类：不同的分离机理，K的含义不同?吸附色谱法 →吸附系数;?分配色谱法→ 分配系数;?子交换色谱法 → 离子交换系数; ④空间排阻色谱法 →分子排阻系数
???④统称K
1、吸附色谱（液-固吸附色谱）：使用固体吸附剂，分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附——解吸的平衡过程。常用的吸附剂如硅胶、氧化铝等，粒度5～10μm。---常用于分离同分异构体。 2、分配色谱（液-液分配色谱）：使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离, 分别进入两相分配而实现分离。分离过程是一个分配平衡过程。---正相色谱和反相色谱（RPC占70%以上）
3、离子交换色谱：固定相是离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。---主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4、 空间排阻色谱（凝胶色谱）：固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。---常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 按固定相的固定方式分类
柱色谱：填充柱色谱、毛细管柱色谱
平面色谱：纸色谱、薄层色谱、高分子薄膜色谱 根据极性分类
正相色谱：流动相极性＜固定相极性 ——极性固定相
——非极性流动相（加极性调节剂如氯仿） ——极性柱（正相柱）
反相色谱：流动相极性＞ 固定相极性 ——非极性键合固定相（ODS） ——极性流动相
——非极性柱（反相柱）
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 一、高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 活塞型往复泵——液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵
梯度洗脱：是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。
a.高压梯度 ( 或称内梯度系统 )：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。 b. 低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。 二、 进样器
将样品溶液准确送入色谱柱的装置——手动方式、自动方式
进样器要求：密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。常用进样器——六通阀进样器 三、色谱柱
常用的标准柱型是内径为4.6或3.9 mm，长度为15～30cm的直形不锈钢柱。基质 (硅胶或高分子聚合物微球)。功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团)
四、检测器
用来连续检测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应（紫外、荧光、电化学检测器） 总体检测器：对试样和洗脱液总的理化性质响应（示差折光、电导检测器） 1、紫外检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收。
优点：①灵敏度高；②对温度和流速不敏感；③可用于梯度洗脱； 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质。
光电二极管阵列检测器：阵列由几百至上千个光电二极管阵列，各检测一窄段波长，计算机快速处理，（时间-波长-吸光度）三维立体谱图。
二极管阵列检测器的优点：①采集三维谱图；②峰纯度检验；③光谱库检索；④可以发现单
波长检测时未检测到的峰 2. 荧光检测器
原理：基于被分析组分被紫外光激发后，能发射可见光（荧光），根据荧光强度进行检测。 优点：①灵敏度高，是最灵敏的检测器之一；②选择性好；③对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。 缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质
可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系） 3. 示差折光检测器
原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。 适用于糖类和脂类 优点：通用型检测器；缺点：①对温度变化敏感；②对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测；③属于中等灵敏度的检测器。 4. 蒸发光散射检测器
原理：流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂挥发后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室中，检测散射光的强度。
优点：消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗脱，灵敏度高，是HPLC的通用型检测器。 缺点：不能使用不挥发性盐做流动相，如磷酸盐。
常用的基本术语：1、流出曲线和色谱峰；2、基线、噪音和漂移；3、峰宽——柱效参数；4、峰高和峰面积——定量参数；5、保留值——定性参数；6、分配系数和容量因子——相平衡参数；7、等温线；8、分离因子和分离度——分离参数 1．色谱图和色谱峰
2．基线、噪音和漂移
基线：仅有流动相通过检测器时产生的信号曲线。
噪音：仪器本身所固有的，以噪音带表示（仪器越好，噪音越小） 漂移：基线向某个方向稳定移动（仪器未稳定造成） 3．峰宽 peak width：色谱柱效参数
标准差σ：σ为正态分布曲线两拐点间距离的一半。对应0.607h处峰宽的一半。 峰宽W：色谱峰两侧拐点切线与基线相交的截距。 半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽。
σ越小，峰越窄，柱效越高。除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积。
4．峰高和峰面积：色谱定量参数