置37度恒温培养箱中培养24-48h。
3.观察记录 在培养基中加入乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿试管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂。观察记录结果
（四）糖发酵试验
1.试管标记 取分别装有葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养液试管各4支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
2.接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录
【实验结果与分析】 （一）V-P 结果 大肠 — 产气 + 枯草 — 变形 — 对照 — 产气肠杆菌结果为阳性，其余为阴性。
（二）甲基红 结果 大肠 + 产气 + 枯草 + 变形 — 对照 — 大肠杆菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌结果为阳性，变形菌为阴性。
（三）糖发酵 葡萄糖 颜色 是否产气 乳糖 颜色 是否产气 蔗糖 是否产气 大肠 + + + + — — 产气 — — — — — — 变形 + — + — + + 对照 — — — — — — 大肠杆菌可以利用葡萄糖和乳糖，并且产气；普通变形菌可以利用葡萄糖、乳糖和蔗糖并且在蔗糖中产气。
（四）吲哚实验 结果 大肠 + 产气 — 枯草 — 变形 + 对照 — 大肠杆菌和普通变形菌结果为阳性，其余为阴性。
灭菌及无菌操作
灭菌原理与方法
灭菌(sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或 去 除 物 料 或 设 备 中 所 有 微
生 物的技术或工艺过程。 （一）、化学物质灭菌
通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。
不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。 4.有机化合物
乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。 (二)、辐射灭菌
1.紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭 氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。 （四）、干热灭菌 1.火焰灼烧法
2.干热空气灭菌法：140~160℃维持2~3h。 （五）、湿热灭菌
湿热灭菌条件为121℃维持20~30min。 巴氏杀菌（Pasteurization）低温消毒法，主要应用于生产酸奶乳制品。目前国际上通用的巴氏
高温消毒法主要有两种：
1.一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等， 但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。 第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保 温1 5~16秒 ，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌 的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。
无菌操作
三、实验操作步骤
灭菌：高温蒸汽灭菌锅20 MIN，120 ℃
标记：用记号笔对待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。 稀释菌：酒精灯附近进行
混合菌液和熔化冷却至培养50-60 ℃（手触可接受温度）以下的培养基倒平板 培养：平板倒置培养基面在上放37 ℃培养箱中培养24-36小时。
四、实验过程中的注意事项
1.无菌接种技术 无菌操作需在火焰旁进行，手不可触摸试管口端，以防烫伤；接种时接种环不要碰触试管口边，
防止污染；塞盖不可放在桌面上，应该用右手手缘或右手指间夹住，或玻璃盖放后火焰灭菌盖上。操作台及不可高温蒸汽灭菌物品使用前和使用后用75%酒精消毒。
2平板分离技术
倒平板时，培养皿边缘不要沾染培养基，摇匀培养基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养皿；平板培养微生物时一定要倒置培养。 七、实验结果
1．记录液体培养基和固体斜面培养基上，细菌的生长状况。 2．记录菌种分离培养的结果。 无菌操作台：
一般来说有以下几个步骤
1、放入物品（菌种除外），打开紫外灯消毒，一般20-30分钟 2、关闭紫外灯，打开风扇通风（如果比较暗还需打开照明灯） 3、用消毒液（75%酒精等）进行台面擦拭消毒 4、实验操作
5、收拾台面，关闭风扇，关闭总电源（如果不想实验菌扩散，也可开紫外半小时后再关闭） 不同型号可能有所不同，具体看看说明书 3.1从土壤中分离和纯化微生物实验方法和步骤 （1）采土样
选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤数10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。 （2）制备土壤稀释液
称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，10-7各种稀释度的土壤溶液。 3.2涂布
用一支1mL无菌吸头分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的肉汤蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做3个平板。 3.3培养
将平板倒置于37℃温箱中培养48h。统计每个平板长出的平均菌落数。根据下面菌落计数方法，算出每克土壤中的细菌含量。 3.4菌落计数方法