微生物肥料中两种菌的最适培养方法
2012级生物工程1班 姚茂林
摘 要
微生物肥料通常是指利用发酵技术生产出的含有特定有益微生物的液体活菌制剂,或该菌液经无菌载体吸附后而制成的固体活菌制剂。随着我国绿色农业的蓬勃发展,微生物肥料在农业生产中越来越受到人们的重视。本文主要论述述了微生物肥料中两种有益菌(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)的扩大培养和在固体培养基上的培养。探讨了如何使固体微生物肥料中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌都在实验室远远超过国家规定菌数，以便在工厂里生产时能达到国家规定的要求。这个实验的探讨方向主要是从选择培养菌数最多的培养基、两种菌的分别的最佳摇床时间、两种菌的最佳混合配比三个方面进行比较，最后对比结果得出最适合的培养方法是使用加豆粕和麸皮的营养肉汤培养基进行菌种扩大培养。
关键词
微生物肥料；生物肥料；绿色农业；枯草芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌；最大菌数；液体培养基；固体培养基。 1 前言
微生物肥料又称生物肥料、菌肥、接种剂，是一类以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微生物活体制品。由于微生物种类繁多、功能多样，研究和应用的潜力巨大。目前，微生物肥料在提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用，保护环境，以及提高农作物产品品质和食品安全等方面已表现出不可替代的作用。尤其是在人类面临能源危机、资源紧缺、环境污染等压力下，为了我国农业的可持续发展，研究和应用微生物肥料是一条必由之路，近10年的实践也已证明了这一观点。自20世纪90年代后期，微生物肥料的研究与应用有向多菌株复合方向发展的趋势，不同功能的多菌株组合、功能互补的复合微生物肥料已成为研究和应用的主要发展方向。这需要研究者在深入了解有关微生物特性的基础上，采用新的技术手段，根据用途把几种所用菌种进行科学、合理组合，使某种或几种性能的菌种组合后微生物肥料功效明显提高，发挥复合或联合菌群的互惠、协同、共生等作用，减少相互拮抗的发生。
1 材料与方法
1.1 液体培养基的制备 1）培养基分为三组
1组为普通的营养肉汤培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、水1000mL、调节PH7.0；
2组为中国普通微生物菌种保藏管理中心推荐使用的加富培养基：豆粕30g、麸皮50g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、5mg/L MnSO4.H2O(注：配制时麸皮、豆粕混合加0.2%NaOH溶液1L，煮沸1h后过滤。然后再滤液中加其余成分，加热溶解后分装。
3组为实验室做的优化培养基：豆饼粉10g、葡萄糖2g、蛋白胨2g、K2HPO42g、KH2PO4 0.5g、硫酸铵0.4g、硫酸镁0.2g、碳酸钙5g、水1000ml,PH7.0-7.5.并可在其中加入山梨酸0.2%、苯甲酸甲酯0.1%、丙酸0.3%中的一种来促进孢子萌发。 按照上述三中营养培养基配方，进行计算、称量、溶化、调节PH等步骤配置好液体培养基。
2）将以上培养基分装到250ml的烧瓶中，并标记清楚。 3）121℃高压灭菌30 m in 备用。
4）将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌在超净工作室中接种到250 m l的上述三种培养基中,如下接种第一组、第二组、第三组培养基各接一瓶088菌和一瓶106菌，摇匀,37℃摇床内培养 。
1.2 菌种的培养时间控制
1）用上述第二种培养基对两种菌按照上述步骤从新培养。
2）每隔一天观察液体培养基中的情况，并记录各瓶中菌的生长情况，是否变浑浊，如果变浑浊，需记录变浑浊的培养时间，并拿出摇床，测菌数。没有变浑浊的继续培养。
3)测菌数样品
稀释液的制备，准确吸取取待测样品l0ml，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液5ml，移入装有45ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液5ml，移入装有45ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液。 用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。因此，若出来的结果10-6上的菌数为几十个或以上，则应继续稀释到10-7。
涂抹平板计数法先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，并记录实验时间，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上203～0min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。
选择每一种培养基的每个菌种两个菌落张的较好，菌落数在20 CFU～200 CFU，又没有杂菌污染的梯度（每一梯度三个平行），查菌落数后，应用MPN计数按照公式：
计算活菌数，把结果记录下来。
4）第三步中原液体培养基，继续放回摇床培养，每隔一定时间按第三步中的步骤测一下菌数并计算出每毫升的含菌量。
5）把106、088两的一定培养时间的菌数进行比较，选出最优培养基和两种菌的最适摇床培养时间。
1.3 把液体培养基中的菌转移到固体培养基中
1）固体培养基的制作
豆粕1/4、麸皮和草炭各1/2，蔗糖0.1%、酵母膏4‰、蛋白胨2g、K2HPO40.5‰、KH2PO40.2%、硫酸铵1.2％、硫酸镁0.08％、PH6.0左右，用石灰水调节。清洗六个罐头瓶，并121℃灭菌30min，然后按照上述配方计算、称量、混匀、调节PH、分装。
2）088菌和106菌各吸取液体菌5ml到6罐固体培养基中，放置恒温箱培养 3）一定时间后，观察菌落形态，并将6罐088、106固体培养罐拿出。可观察到088和106菌落形态的不同，枯草芽孢杆菌菌落不规则，表面有裂纹时，裂纹也不规则；地衣杆菌菌落规则，圆形较光滑，表面有裂纹时，裂纹呈花形。 4）将两种固体培养基取出用纱布包裹并在40℃下烘干。
5）将088、106烘干的样研磨成粉状。
6）准确称取研磨粉状物l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释，依次做六个梯度，测出固体培养基中的菌数。
7）再过一段时间，两固体培养基有明显变化时，再测菌数，并将记录两种菌随时间的变化，选出两种菌数量同时达到比较高的时间，进行混合。
1.4 088菌和106菌的混合
由于做过验证试验可以证明088和106这两种菌的培养后混合比混合后培养两种菌的数量都高，因此采取培养后混合。
把088 和106 按1∶1的比例和1∶2的比例混合两种固体培养基上的菌 1）从恒温箱里分别取出1罐已经培养72小时的106菌和088菌。 2）用2块纱布分别包裹好取出的固体菌，并标记。 3）在40℃下烘干，并研磨成粉状。 4）把研磨后的固体菌装袋，标记。
5）分别称取10g106菌和088菌按照1:1的比例有180ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s。 6）同理，分别称取6.7g106菌和13.4g088菌按照1:2的比例有180ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s。
7）同理，分别称取6.7g088菌和13.4g106菌按照1:2的比例有180ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s。
8）放置24小时后，对三组混合菌做平板，36h后测各组菌数，以上三组实验